CS268052B1 - Způsob výroby diagnostického přípravku ke stanovení <X, - antitrypsinu - Google Patents

Abstract

Způsob výroby diagnostického přípravku ke stanovení c< j- antitrypsinu v biologickém materiálu na známém principu imunizace zvířat, vyznačený purifikací imunogénu působením jednoho až čtyř hmotnostních dílů zvířecího imunoglobulinu na jeden hmotnostní díl lyofilizovaného lidského o/,- antitrypsinu, získaného z lidského séra dvojím srážením balastních sérových bílkovin pevným síranem amonným při koncentraci 400 g síranu amonného na 1 litr roztoku lidských sérových bílkovin. Zví- . řečí imunoglobulín protilátkově aktivní proti minoritním komponentům lidské <X globulinové frakce se vyrobí imunizací zvířete surovým nepuriFi kovaným lidským i- antitrypsinem a upraví se vysycením,tj. přídavkem purifikovaného lidského pí ,- antitrypsinu k antiséru tak, aby ancisérum neprecipitovalo C< antrítrypsin, ale aby precipitova lo minoritní ,- globulinové Frakce. Směs obou lyofilizátů, tj. OÍ j- antitrypsinu a imunoglobulinu proti minoritním komponentům se rozpustí y 0,06 M fosfátovém nárazníku, profiltruje vrstvou dietylaminoetylcelulózy při pH 6,8 a θζj- antitrypsin se oddělí od volné protilátky a od komplexů v rozmezí molarity 0,06 M- 0,3 M, čímž se zbaví minoritních komponentů, které rozhodují o hospodárnosti výroby. Imunizace prasat purifikovaným lidským cA ,- antitrypsinem se provede ve třech až pěti dávkách, injikací po 5 ml aluminumhydroxidové suspenze, vpichuje se 0,02% až 1% roztok Xj- antitrypsinu pětkrát ředěný suspenzí, imunizace kozse provádí kontinuálně po delší časová období v menších dávkách, úměrných hmotnosti zvířete. K séru imunizovaných zvířat se přidá albumin, orosomukoid, nebo jiná frakce lidského séra, a produkt se izoluje.

Description

I Vynález uvádí způsob výroby diagnostického přípravku ke stanovenícK·^ - antitrypsinu j v biologickém materiálu,u kterése řeší dosažení požadované specificity diagnostika purí, rifikací antitrypsinového imunogénu a úpravou diagnostického séra se zřetelem k mino řitním komponentům^ - globulinové frakce séra. Tyto minoritní komponenty lidského sé{ ra kontaminuji preparáty- antitrypsinu, jsou obtižnš prokazatelné a odstranitelné, avšak uplatňuji se rozhodujícím způsobem v ekonomice výrobního procesu a v kvalitě antitrypsxnového diagnostika.

V současné době produkuje diagnostický přípravek několik předních světových výrobců. Z analýz komerčních diagnostik, provedených v Ústavu sér a.očkovacích látek v Praze (odbor imunochemie) vyplývá, že pouze přípravek jednoho výrobce /DAKOPATTS, Dánsko/ splňuje požadavek monospecificity. Ostatní analyzované komerční preparáty, ač'deklarovány jako monospecifické, dávají v imunbelektroforéze ještě nežádoucí vedlejší nespecifickou reakci s neidentifikovaným minoritním proteinem, viditelným vc<^ - frakci jako samostatný precipitačni oblouček. Problematiku odstraněni minoritních složek z antitrypsinu uvádi odborná literatura /Piero Musiani and Thomas B.Thomasi, 3r.: Isolation, chemical, and physical properties of - antitrypsin. Biochemistry, 15,798 (1976)/.

. V ČSSR byl způsob výroby antitrypsinového diagnostika předmětem několikaletého výzkumu, posouzen oponenty a uveden do praxe. Brzy po zahájení výroby se ukázalo, že nelze diagnostikům nadále vyrábět pro neodstranítelné nespecificity, velmi slabý titr protilátek a velký počet neúspěšně imunizovaných zvířat. Byl proto vyhlášen podnikový tématický úkol č. 3/81 Zvýšení hospodárnosti, produktivity a produkce prasečího antiséra - antitrypsin, jehož řešitelem je autor tohoto vynálezu.

Podstatou vynálezu je způsob výroby c>^ - antitrypsinového diagnostika, založené¹ ho. na známém principu imunizace produkčních zvířat, vyznačující se tím, že na jeden hmotnostní díl lyofilizovaného lidského - antitrypsinu se působí jedním až čtyřmi díly zvířecího imunoglobulinu protilátkově aktivního proti minoritním komponentům cč·^ globulinové frakce lidského séra, roztok obou bílkovin v 0,06 M fosfátovém nárazníku pH 6,8 se profiltruje vrstvou dietylaminoetylcelulózy, jímají se vytékající frakce, frakce - antitrypsinu eluovaná ze sloupce v rozmezí 0,06 až 0,3 14 fosfátového nárazníku se potom injikuje produkčním zvířatům (králíkům, kozám, prasatům, ovcím, nebo jiným zvxřatům)v dávkách 0,2ml až 5 ml v koncentraci 0,02 % až 1 % antitrypsinu, a to ve 3 až 5 injekcích pro 1 zvíře. K séru imunizovaných zvířat se potom přidá albumin, orosomukoid, nebo jiná frakce lidského séra za účelem odstranění (vysycení) průvodních nežádoucích protilátek, které imunizační postup prakticky vždy provázejí. Po vysycení se produkt izoluje bu3 v podobě antiséra, nebo se z antiséra izoluje imunoglobulin, po případě specifická protilátka. Zvířecí imunoglobulin protilátkově aktivní proti minoritním komponentům lidské - globulinové frakce séra se vyrobí tak, že produkčnímu zvířeti stejného živočišného druhu použitému k výrobě diagnostika, se vpichuje surový lidskýoý^ - antitrypsin, alternativně i rozpustná síranová frakce lidského séra sraženého - síranem amonným při 40% nasyceni, a to nejméně ve 3 až 5 injekcích k dosažení co nejvyššího titru protilátek. Za 6 až 10 dnů po poslední injekci se získá zvířecí serum, ke kterému se přidá co nejmenší množství lidského<X^ - antitrypsinu, právě postačující * k odstranění protilátek protio^ - antitrypsinu, přičemž ostatní protilátky v antiséru zůstávají nevysyceny. Přítomnost jakýchkoli jiných protilátek v antiséru-jiných, než antitrypsinových-není na závadu. Z takto vysyceného antiséra se připraví imunoglobulin, jakýmkoli vhodným způsobem, například vysrážením 2M síranem amonným. Izolovaný protilátkový imunoglobulin proti minoritním komponentům - globulinové frakce séra se potom dialýzuje a lyofilizuje. K oddělení volné protilátky od rozpustných antigen-protilátkových komplexů dojde v největší míre v dalším purifikačním stupni ve vrstvě dietylaminoetylcelulozy, jak již bylo uvedeno.

CS 268052 Bl

Vynález řeší zvláště obtížný technologický problém, mající rozhodující význam pro použitelnost- antitrypsinového diagnostika v kvalitativní i kvantitativní imunodiagnostice. PreparátyoCy - antitrypsinu obsahují vždy 3 až 4 stopové minoritní komponenty v oblastic<2 “ - frakce séra, které Jsou velmi nebezpečné pro zdar výroby;

jsou obtížně prokazatelné přímou imunoprecipitací, avšak injikovány zvířatům, navozuji u zvířat precipitující protilátky. Tyto protilátky jsou na rozdíl od benigních“ protilátek, jako je albumin, orosomukoid a většina ostatních bílkovin, maligní”, protože jsou neodstranítelné, čímž zabraňují dosažení požadované specificity diagnostika. Konečným důsledkem je pak výrobek neprodejný, nepoužitelný k specifickým kvalitativním a kvantitativním analýzám, což vede k hospodářským ztrátám. Důvodem neodstranítelnosti minoritních protilátek je absence minoritních proteinů v dostupných frakcích lidského séra, vhodných k úpravě (vysyceni) diagnostika. '

Způsob výroby diagnostika podle vynálezu vede u imunizovaných zvířat ke vzniku anťitrypsinových protilátek s dobrou reprodukovatelností výrobních cyklů. Zvířecí protilátka proti minoritním komponentům je použita v purifikačním stupni preparace imunogénu ve volném, nevázaném stavu, neovlivněném vazbou na pevný nosič. Má proto i větší vazebnou kapacitu, lze ji dobře dávkovat a kontrolovat její účinnost. Protilátkou vázané nežádoucí konteminanty se spolu s nadbytkem nevyvázané protilátky odstraní přímo v purifikačnim stupni, což je nemalou výhodou, protože namísto- antitrypsinu lze použit k přípravě imunogénu celkem jednoduše připravenou rozpustnou síranovou frakcí lidského séra, získanou při 40% nasycení síranem amonným. Průvodní orosomukoid a albumin sice navodí u imunizovaných zvířat precipitační protilátky, ale ty lze snadno odstranit vysycovánim antiséra; navíc tyto frakce mají značný stabilizační vliv a omezují denaturaci antitrypsinu, ke které jinak ve značné míře dochází. Oproti protilátce fixované na pevný nosič (například ňa CN Br/sepharózu) je volná protilátka použitelná v průmyslovém měřítku s minimálními náklady. Vynález dosahuje zjednodušením preparace imunogénu, vysokou produktivitou a dobrou reprodukovatelností výroby nového a vyššího účinku v současné etapě způsobu výroby antitrypsinového diagnostika.

Přiklad 1

Nepurifikovaný, surový- antitrypsin se vyrobí tak, že k 1 litru smíšeného séra (odpadního, tak zvaného sběrového) se přilije 1 litr 0,15 M chloridu sodného a ve směsi se rozpustí pevný síran amonný v hmotnostním množství 800 g. Sraženina se odcentrifuguje, filtruje se supernatantni tekutina přes mikrobiologický filtr, díalýzuje proti destilované vodě a lyofilizuje se. Tato lyofilizovaná frakce slouží jednak jako imunogén k získání protilátek proti minoritním frakcím séra, jednak Jako základ k výrobě čistého imunogénu.

Příklad 2

Částečně purifikovaný - antitrypsin se vyrobí tak, že 2,5% roztok surového - antitrypsinu z příkladu 1, rozpuštěný v 0,05 M fosfátu pH 6,B se sráží síranem amonným postupem shodným s příkladem 1. Lyofilizací a rozpuštěním se získá roztok antitrypsinu, vhodný k přípravě imunogénu, purifikovaného protilátkou proti minoritním komponentům.

Příklad 3

Imunoglobulin protilátkově aktivní proti minoritním komponentům - globulinové frakce séra byl získán tak, že produkční zvíře - prase - bylo injikováno 4x v intervalech tří týdnů nepurifikovaným, surovým- antitrypsinem z přikladu 1, přičemž každá imunizační dávka obsahovala 20 mg frakce z příkladu 1. Za 3 týdny po čtvrté injekcí byl k séru imunizovaného zvířete přidán purifikovaný lidskýX^ - antitrypsin v hmotnostním množství právě postačujícím k odstranění protilátek proti Xj - antitrypsinu, a z antiséra byl vysolen imunoglobulin 2M síranem amonným, sraženina rozpuštěna, dialyzována a lyofilizována·

CS 268052 Bl

Příklad 4

Κ 0,5 g lyofilizovaného lidského - antitrypsinu podle příkl.2 byl přidán 1 g lyofilizovaného prasečího imunoglobulinu proti minoritním komponentům- globulinové frakce lidského séra, směs rozpuštěna v 50 ml 0,06 M fosfátového nárazníku pH 6,8 a profiltrována vrstvou dietylaminoetylcelulózy, frakce purifikovaného o< χ - antitrypsinu eluována z vrstvy při zvýšené molaritě nárazníku v rozmezí 0,06M až 0,3M. Frakce obsahujících - antitrypsin byla potom použita jako imunogén k injikaci zvířat. Příklad 5

Injikace prasat byla prováděna ve třech injekcích po 3 týdnech po 5 ml aluminiumhydroxidové suspenze (Al-Span) obsahující 0,1 mg až 0,3 mg purifikovanéhoantitrypsinu z přikladu 4, poslední injekce obsahovala 10 mg imunogénu (čtvrtá injekce). Za týden až 10 dnů byla získána antiséra, vysycena přídavkem roztoku lidského albuminu a individuálně podle imunoalektroforetického spektra orosomukoidovou, nebo i jinou frakci lidského séra za účelem dosažení požadované specifičnosti produktu. Příklad 6

Injikace koz byla prováděna kontinuálně po dlouhá časová období vpíchnutím (po poradě s veterinářem) minimálního objemu emulze z příkladu 5, který zpravidla nepřevyšoval 2 až 3 ml. Podle zdravotního stavu zvířete byly potom prováděny odběry krve a při pozorovatelném poklesu titru protilátek bylo zvíře reimunizováno. Vysycení antiséra prováděno analogicky.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob výroby diagnostického přípravku ke stanovení - antitrypsinu na principu imunizace zvířat, vyznačující se tim,. že na jeden hmotnostní díl lidského~ antitrypsinu se působí jedním až čtyřmi díly zvířecího imunoglobulinu protilátkově aktivního proti minoritním komponentům tX}. “ globulinové frakce lidského séra, roztok obou bílkovin se profiltruje vrstvou dietylaminoetylcelulózy, frakce 0^^ - antitrypsinu se vpichuje jako 0,02 až 1% roztok v dávkách 0,2 ml až 5 ml ve čtyřech nebo více injekcích králíku, koze, praseti, ovci, nebo jinému zvířeti, k séru imunizovaných zvířat se přidá albumin, oroso.mukoid, nebo jiná frakce lidského séra, a získaný produkt se izoluje.