CS267820B1 - Způsob imobilizace glykoproteinů, sacharidů, polysacharidů, nukleotidů a jiných sloučenin obsahujících reaktivní karbonylovou skupinu - Google Patents

Abstract

Řešení se týká způsobu imobilizace glykoproteinů, sacharidů, polysacharidů a nukleotidů a jiných sloučenin obsahujících reaktivní karbonylovou skupinu. Podstata způsobu imobilizace glykoproteinů, sacharidů, polysacharidů, nukleotidů a jiných sloučenin obsahujících reaktivní karbonylovou skupinu podle řešení spočívá v tom, že nosičem pro imobilizaci je makroporézní perlová celulóza s navázaným dihydrazidem karboxylové kyseliny obecného vzorce I, kde n je 0 nebo 1, a R je -(CH„).-, -(CH ),-, -C,H.- a X -OH, -NH-NH-CO-R-CO-NH-NH,. Cukerná složka se při tomto způsobu^navazuje prostřednictvím reaktivní karbonylové skupiny bud v ní již původně obsažené nebo zavedené selektivní oxidací jodistanem nebo jinou o sobě známou reakcí.

Description

Vynález se týká způsobu imobilizace glykoproteinu, sacharidů, polysacharidů, nukleotidů a jiných sloučenin obsahujících reaktivní karbonylovou skupinu na makroporézní perlovou celulózu s navázanými hydrazidovými skupinami.

Při imobilizaci enzymů nebo jiných bílkovin proteinů na nosič chemickou vazbou se dosud v naprosté většině případů využívají reaktivní skupiny jejich aminokyselin. Takový postup však vždy skrývá nebezpečí, že při něm může být v různém stupni poškozena oblast podstatná pro specifickou vazebnou nebo katalytickou funkci proteinu nebo alespoň snížena jeho stabilita. Živá buňka naproti tomu často používá pro vazbu cukerné složky. Tak například proteolytický enzym karboxypeptidasa Y z droždí obsahuje cukernou složku, kterou je vázán v buňkách Saccharomyses cerevisiae na membrány vakuol. Stabilita tohoto enzymu velmi závisí na obsahu cukerné složky. 3iž Margolis a spol. (3. Biol. Chem. 253 (1978) 7891) ukázali, že z různých druhů droždí lze izolovat karboxypeptidasu Y s molekulovou váhou 49 000 až 65 500. Rozdíly v molekulových vahách jsou způsobeny pouze rozdíly obsahu cukerné složky, na kterém pak přímo závisí stabilita enzymu. Marshall a Rabinowitz (Biotechnol. Bioeng. 18 (1976) 1325 až 1329) prokázali zvýšení stability katalasy, trypsinu i 2-amylasy modifikací dextranem. Velký význam cukerných složek při lokalizaci a na ní závisející aktivitě byl prokázán již pro velký počet nejrůznějších biologicky aktivních sloučenin (Gensburg V., Robins R. W., eds. Biology of Carbohydrates, Vol. 2, Wiley, New York 1984; Brandley Β. K., Schanaar 3. Cell-surface Carbohydrates in Cell Recognition and Response, 3. Leucocyte Biol. 40 (1986) 97-111; Liener I. E., Sharon N., Goldstein I. 3., eds. The Lestins. Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine, Academic Press, New York 1986). Imobilizace enzymů, protilátek, nukleotidů i dalších biologicky aktivních látek pomocí přítomných nebo periodatovou oxidací získaných aldehydických skupin na pevný nosič obsahující například hydrazid adipové kyseliny má proti dosud nejčastěji používaným způsobům celou řadu předností. Tím, že reakce probíhá při nízkém pH (například 4,5), při které nedochází k reakci aldehydických skupin s NH^-skupinami na povrchu bílkovin, zabraňuje polymeraci a nespecifickým vazbám. Přítomnost cukerné složky mezi vázanou biologicky aktivní sloučeninou a pevným nosičem chrání aktivitu imobilizované sloučeniny před případným nepříznivým účinkem nosiče a omezuje možnost ztráty cukerné složky štěpením.

Předmětem vynálezu je způsob imobilizace glykoproteinu, sacharidů, polysacharidů, nukleotidů a jiných sloučenin obsahujících reaktivní karbonylovou skupinu, jehož podstata spočívá v tom, že nosičem pro imobilizaci je makroporézní perlová celulóza s navázaným dihydrazidem dikarboxylové kyseliny obecného vzorce I

Cel-(O-CH₂CH₂)_n-O-Z^N\-NO-NH-CO-R-CO-NN-NH₂ (I)

kde π je 0 nebo 1, a R je -(CH,,)^-, -(CH₂)$-, a X -OH, -NH-NH-C0-R-C0-NH-NH₂.

Způsob podle vynálezu je založen na schopnosti hydrazidové skupiny (-CO-NH-NH?) reagovat za mírných podmínek se sloučeninami obsahujícími reaktivní karbonylové skupiny (aldehydické, keto, volné či vhodné deriváty nebo některé deriváty karboxylových nebo jiných kyselin) za vzniku vazby dostatečně hydrolyticky stálé. Přitom navazovaná sloučenina buď potřebnou karbonylovou skupinu již původně obsahuje, například redukující mono nebo oligosacharidy a látky, které je obsahují nebo se do nich vhodným způsobem dodatečně uvedou, například selektivní oxidace sacharidů jodistanem. Použitelná je také vazba alkylační reakcí. Uvedené reakce se mohou využít také při navazování

CS 267 820 Bl hydrazidové skupiny na nosný skelet, pokud se pro aktivaci vezme dihydrazid dikarboxylové kyseliny. Tato cesta je pro přípravu sorbentů nejvýhodnější, protože příslušné uvedení reaktivních skupin je v principu známé a také dihydrazidy jsou poměrně dobře dostupné. Délkou řetězce mezi karboxyly je možné ovlivňovat sterickou dostupnost kydrazidové skupiny na sorbentů.

V literatuře jsou popsány a na trhu jsou dostupné sorbenty na agarózové bázi s navázaným dihydrazidem adipové kyseliny. Ale mechanické a tokové vlastnosti agarozových sorbentů nejsou při práci v koloně zdaleka optimální. Také vazba dihydrazidu po vesměs používané aktivaci bromkyanem, není dostatečně hydrolyticky stálá. Tyto nedostatky jsou odstraněny u sorbentů podle vynálezu. Makroporézní perlová celulóza má velmi dobré mechanické a tokové vlastnosti a regulovatelnou velikost pórů. Vazba dihydrazidu po aktivaci 2,4,6-trichlortriazinem má hydrolytickou stabilitu srovnatelnou se stabilitou hydrazidové skupiny.

Příklad 1

Do roztoku 505 mg dihydrazidu kyseliny adipové v 50 ml 0,05M borátového pufru pH 9 se za míchání přidá 50 g vody odsáté perlové celulózy čerstvě aktivované 2,4,6-trichlortriazinem (89,2 umol triazinu/g suchého materiálu). Reakční směs se míchá při teplotě místnosti 4,5 hodiny. Přitom se udržuje pH 9 přídavkem hydroxidu sodného (NaOH). Produkt se promyje vodou. Obsahuje B,5 umol dihydrazidu/ml zbotnalého materiálu. Příklad 2

Při jinak stejném provedení jako v příkladu 1 jen aktivovaná celulóza obsahovala 116 umol triazinu/g a pro reakci použito 657 mg dihydrazidu byl připraven sorbent obsahující 12,8 umol dihydrazidu/ml zbotnalého materiálu.

Příklad 3

Ke 100 mg invertasy rozpuštěné ve 100 ml 50 mM acetátového pufru pH 5 bylo přidáno 10 ml 50 mM jodistanu sodného (NaJO^). Směs byla míchána na rotační třepačce v temnu při 4 °C 5 hodin. Nezreagovaný NaOO^ byl odstraněn 0,2 ml ethylenglykolu. Oxidovaná invertasa po 30 minut následujícího míchání byla dialysována proti 0,lM acetátovému pufru pH 4,5. Oxidovaná a dialysovaná invertasa byla smíchána s 10 ml odsáté celulózy s navázaným dihydrazidem adipové kyseliny. Reakční směs byla míchána při 4 °C 16 hodin. Imobilizovaná invertasa byla převedena do kolony, kde byla promyta střídavě 0,lM acetátovým pufrem pH 4,5 a stejným pufcem nbsahujícím 1M NaCl, dokud invertasová aktivita byla detekovatelná v promývacím pufru. Aktivita imobi1izované invertasy stanovena pomocí sacharosy metodou popsanou Markem a spol. (Biotechnol. Bioeng. 26 (19B4) 1223-1226) byla 5,5 jednotek (= umolů hydrolysované sacharosy za sekundu) vztaženo na 1 g suchého konjugátu. Množství navázané invertasy stanovené pomocí aminokyselinové analysy kyselého hydrolysátu imobilizovaného enzymu (6N HC1, 110 °C, 20 hodin) bylo 87 mg invertasy/g suchého konjugátu.

Příklad 4

K 10 mg karboxypeptidasy Y rozpuštěné v 6 ml 0,lM acetátového pufru pH 5,0 bylo přidáno 0,6 ml O,1M jodistanu sodného (NaJO^) a další postup byl stejný jako v příkladě 1. Množství navázané karboxypeptidasy Y bylo 1,0 mg karboxypeptidasy na 1 g suchého konjugátu. Aktivita stanovená pomocí N-karboxy-benzoxy-L-fenyl-alanyl-L-alaninu byla 210 jednotek/g suchého konjugátu (jedna jednotka je hydrolýsa 1,0 umolu N-CB2-Phe-Ala na N-CBZ-L-fenyl-alanin a L-alanin za minutu při 6,75 a 25°C podle Johansena a spol.

CS 267 820 Bl (Carlsberg. Res. Kommun. 41 (1976) 1 až 14).

Příklad 5

Jedna desetina objemu O,1M jodistanu sodného (NaJO^) byla přidána k roztoku polyklonálních protilátek proti ovalbuminu (1 až 2 mg/ml) v O,1M acetátovém pufru pH 5,5. Směs byla míchána na rotační třepačce při 4 °C 20 minut. Reakce byla zastavena přídavkem glycerinu na koncentraci 0,015M. Směs byla míchána za stejných podmínek dalších 5 minut. Reakční směs byla aplikována na kolonu Sephadexu G-25 (30 x 1,6 cm) ekvilibrovanou O,1M acetátovým pufrem obsahujícím 0,5M NaCl, pH 4,8. Oxidovaný imunoglobulin byl eluován stejným pufrem. 20 ml získané odsolené frakce protilátky bylo smícháno s 10 ml celulózy s navázaným dihydrazidem adipové kyseliny ekvilibrované stejným pufrem. Vazba byla prováděna opět na rotační třepačce při 4 °C 48 hodin. Reakční směs byla převedena na kolonu a promývána stejným pufrem až absorpce eluátu při 280 nm byla menší než 0,01. Množství navázané protilátky stanovené na základě aminokyselinové analýsy stejné jako v případě 1 bylo 1,2 mg bílkoviny/g suchého konjugátu.

Příklad 6

K 60 mg ovalbuminu rozpuštěného v 60 ml 0,lM acetátovém pufru pH 5,5 bylo přidáno 6 ml 0,lM jodistanu sodného (NaJO^) a mícháno na rotační třepačce za temna 20 minut při 4 °C. Po oxidaci přidán glycerin na celkovou koncentraci 0,015M a mícháno dalších 5 minut při 4 °C. Roztok ovalbuminu po oxidaci byl odsolen na koloně Sephadexu G-25 (3 x 3,5 cm) v 0,lM acetátovém pufru obsahujícím 0,5M NaCl pH 4,8. K získaným 25 ml roztoku ovalbuminu (^230 = 0,540) bylo přidáno 5 ml perlové celulózy s navázaným dihydrazidem adipové kyseliny ekvilibrované stejným pufrem. Vazba byla provedena mícháním na rotační třepačce 48 hodin při 4 °C. Po ukončení vazby převedena suspenze na kolonu, kde byla promývána stejným pufrem, až absorbance při 280 nm eluovaném pufru byla menší než 0,01. Množství navázaného ovalbuminu stanovené aminokyselinovou analysou jako v případě 1 bylo 18 mg/g suchého konjugátu. Získaný imobilizovaný ovalbumin byl použit pro přípravu velice, účinného biospecifického sorbentu pro lektin konkanavalin A pomocí izolace polyklonálních protilátek proti ovalbuminu. Tyto byly navázány způsobem popsaným v případě 3. Vzniklý biospecifický imunosorbent byl použit k isolaci ovalbuminu za adsorpce mimo cukernou oblast, komplementární pro vazebné místo konkanavalinu A. Vazba ovalbuminu na zmobilizovanou protilátku pouhou adsorpcí je tak silná, že za podmínek afinitní chromatografie konkanavalinu A nedochází k uvolnění ovalbuminu.

Příklad 7

Do roztoku transportní ribonukleové kyseliny (20 mg tRNA/3 ml vody) bylo přidáno 20 mg jodistanu sodného (NaJO^) a mícháno na rotační třepačce za temna 30 minut při 0 °C. Suspense 5 ml perlové celulózy s navázaným dihydrazidem adipové kyseliny a 5 ml 0,lM acetátového pufru pH 4,5 byla po přidání míchána 6 hodin při 0 °C. Po ukončení vazby byla suspense převedena na kolonu a promývána 2M NaCl - 0,lM TRIS-HC1 pufrem pH 8 až do absorbance eluátu menšího než 0,01. Množství navázané tRNA stanoveno na základě analýsy N podle Kjeldahla bylo 5,1 mg/g suchého konjugátu.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob imobilizace glykoproteinů, sacharidů, polysacharidů, nukleotidů a jiných sloučenin obsahujících reaktivní karbonylovou skupinu, vyznačený tím, že se imobilizace

   CS 267 Θ20 Bl provádí ve vodném prostředí pufru při pH 4 až 7 na makroporézní perlovou celulózu s navázaným dihydrazidem dikarboxylové kyseliny obecného vzorce I

   Cel-(0-CH₂CH₂)_n-0-Z X-NH-NH-CO-R-CO-NH-NH₂ N

   X (I) kde n je 0 nebo 1, R je -(CH„).-, C.H.- a X je -OH nebo -NH-NH-CO-R-CO-NH-NH„,

   L 4 L j o 4 Z přičemž cukerná složka buď reaktivní karbonylovou skupinu sama původně obsahuje nebo se do ní zavede selektivní oxidací jodistanem nebo jinou o sobě známou reakcí.