CS266282B1 - Spósob rádioimunochamického stanovenia antigénov s rožnou štruktúrou - Google Patents

Description

CS 266 282 B1

Vynález sa týká spósobu rádioimunochemického stanovenia antigénov s rožnou štruktúrou, Rádio.1 munoanalýza (RTA) ako vysoko citlivá analytická metoda si od svojho zavedeniaYnlovowmi ,i B<m Honoin v toku I ')«, 9 (N.tl.uip I 84 , t 648 ( I *)r, 9 > > nušLa široko up 1 u Lnění e pr íanalýze velkého počtu zlúčenín.

Metoda RJA je založená na schopnosti protilátky a specifického antigénu tvořit’· reverzi-bilný komplex antj .qén-prot i Lá tka. Do Lež itou aúčastou celého rádioiiiiunoeheiitickcho stanoveniaje spósob sepaiáeie volného a viazaného antiyénu. K najčastejšie používaným metodám patřízrážanie polyetylénylykolom, síranom amonným a inýnii organickými zlúčcninami, adsorpciavolného antigénu na aktívnom uhlí, prtp. využitie tzv. druhej protilátky (zvieracej proti-látky proti králieiemu imunoglobu línu) v kombinácii s polyetylénglykolom. Nevýhodou posled-nej z uvedených metod je zvycajne poměrně zloáitý postup optimalizácie separačného systémuvždy iba pro jeden druh antigénu, nevyhnutnosť přídavku gamaglobulínu alebo normálnehokráličieho séra do reakčnej ztnesi a potřeba chladených centrifug. Precipitacná pritilátkanie je stabilní! v roztoku,preto ju výrobcovia RIA-súprav musia dodávat v lyofilizovanomstave a až samotný odběratel si musí precipitačné činidlo připravovat zmiešavaním niekoíkýchsubstancií.

Vedla uvedených separačných metod sa v poslednej době úspěšně presadzuje aj metodapevnej fázy, t. j. protilátok zmobilizovaných na vhodnoni type nosičov. Najvhodnejším sposobomimobilizácie je kovalentná vazba protilátky na polymérny nosič (Santos, I., Waerenborgh, F., Patricio, L.: J. of Radional. Nucl. Chem. 102, 143 (1986)). V systémoch, kde je aplikovanýVhodný typ pevnej fázy, sa spravidla zjednodušuje a skracuje celková doba rádioimunochemickéhostanovenia.

Sposobom podlá vynálezu sa zvieracia (s výhodou kozia) protilátka proti králieiemuimunoglobu I inu i.mobilizuje na nosič, připravený drvením mikrokryštalickej celulózy v keramic-kej nádobě s následnou homogenizácíou jej vodnéj suspenzíe v sklenenom homogenizátore avýberom najjemnejšej frakcie flotáciou; aktivovaný reakciou s 1,1'-karbonyldiimidazolotn.

Pri vlastnom rádioimunochemickom stanovení sa zvieracia protilátka proti králieiemu imuno-globulínu, ímobilizovaná uvedeným sposobom, přidává vždy v rovnakom objeme a koncentraci!k roztoku, obsahujúcemu specifická protilátku, jej antigén značený jódom 125 a analyzovanávzorku, resp. standard. Vzhladom k struktuře použitého nosiča a metóde imobilizácie sasposobom podlá vynálezu dosiahne rovnováhy imunochemickej reakcie specifická protilátka--nešpecifleká protilátka za 1 hodinu pri 20 °C bez ohladu na to, či sa stanovuje antigéns nízkou alebo vysokou molekulovou hmotnosťou. Reakčnú zmes nie je potrebno počas inkubáciemiešať ani třepat, pretože sedimentačná rýchlosť použitého nosiča je dostatočne nízká.

Po ukončení jednohodinovej inkubácie sa nosič s imobilizovanou zvieracou protilátkou protikrálieiemu imunogiobulínu, na ktorej je naviuzaný komplex specifická protilátka-antigén,odstředí zraeria sa radioaktivita sedimentu a porovnáním s hodnotami získanými u štandardovso známými koncentráciami antigénu sa stanoví obsah daného antigénu v neznamej vzorke. Výhodou stanovenia antigénov s rožnou strukturou sposobom podía vynálezu je predo-všetkým výrazná univerzálnost metody, možnost skrátenia a z jedodusema celeho postupu radio-imunochemického stanovenia, vysoký stupen reprodukovatelnosti výsledkov, velmi dobrá vizuál-nost sedimentu, čo zabraňuje jeho případnému odsatiu a tým získaniu nesprávných výsledkov. K dalším výhodám spósobu podía vynálezu patří možnost stanovenia antigénov s rožnou strukturoujednotným postupem za použitia spotočného precipitačného činidla, ktoré je priamo připravenék použitiu a vyznačuje sa velmi, dobrou stabilitou aj v roztoku - pri 4 °C si nezmenenevazobné vlastnosti uchovává po dobu minimálně 4 mesiacov, čo má z technologického hladiskavelký význam, lebo sa takto eliminuje fáza lyofilizácie. Pri vlastnom RIA-stanovení nieje potřebné do reakčnej zniesí přidávat gamaglobulin, normálně králičie sérum alebo polyetylén“glykol, čo umožňuje zredukovat počet pipetovacích krokov. Na oddelenie volnej a viazanejfrakcie postačuje krátká centrifugácia v nechiadenej centrifuge. CS z' 6 6 2 8 2 B l 3 SL.uiovciii (' .ni ti génov s různou strukturou sposobom podlá vynálezu vdaka svojej univerzál1nos ti. v k< )U« · čnom důsledku výrazné netři pracovně kapacity, znižuje technická a materiálovánáročnost opi imnI izácie I-jI; sif.ir wnčJio systému, ako a j celého rádioimunochemického stano-ven 1 .1 . V 11.1 I ' · 1 < · 1- I f niii 11 I ' 1 > ·. 1 (1 y p 1 í t I . 11 lni i !><’,· 1 . 1 h « , ,11 ,y > nimi ol »πκ’< I znvn 1 :

1' r í. k 1 a d I pád io i iiiunoana 1 yza ty 1 o l ropného hormonu (TSH)

Nosíc na imobiI izáciu zvieracej protilátky proti králičiemu imunoglobulínu sa připravídrvením mikroki yst uličkoj celulózy za sucha v keramickéj nádobě. Celulóza sa potom suspendu-]c v dost i. 1 ovane j vodě a homogenizuje v skLcnenom homogenizátore. Frakcia s velkostou častíc5 až 15 ^un, získaná flotáciou, sa potom oddělí a vysuší za mierne zvýšenej teploty. K 5 hmotnostným dieloin takto upraveno j roikrokryštaliekej celulózy sa pridajá 4 hmotnostně dlely1,1'-karbonyldiimidazolu v 40 objemových dieloch acetonu. Aktivácia prebieha 2 h pri teplotě20 Po premyl. í acetónoiu a 0,05 M fosfátovým tlmivým roztokom pH 7,5 sa aktivovaná mikro- kryátal i.ekú celulóza .suspenduje v 40 objemových dieloch fosfátového tlmivého roztoku pH 7,5a ihned sa přidá 5 objemových dielov zvieracej (kozej) protilátky proti králičiemu imunoglo-buLinu. .1 mobi 1 izácia prebieha za tmy po dobu 24 hodin. Iniobilizovaná protilátka sa potompremyje fosfátovým tlmivým roztokom a naciedi v pomere 1:10. Takto připravené precipitačnéčinidlo íe priatuo připravené k použitiu. K 200 ,ul spod fickej protilátky proti TSH sa přidá 200 μΐ standardu, resp. neznámejvzorky krvného séra. Po prodinkubácii 3 dni pri teplote 20 °C sa do reakčnej zmesi přidá1.0 0 /ul TSH značeného jódom 125. Zmes sa nechá stát 24 h pri teplote 20 °C. Potom následujepřidáni·· preeipiLačného činidla po 500 μΐ na skúmavku a inkubácia 1 hodinu pri 20 °C. Pokrátkéj cenl.r.i fugácii (5 až 10 minút pri 2 000 ot./min.) sa supernatant odstráni a zmeriasa radioaktivita sedimentu. TSH možno takto stanovit v koncentračnom rozsahu 0,6 až40 mlU/1 s dostatečnou citlivostou /0,15 rnIU/1) a nízkým variačným koeficientom {do 5,5 %)a nespecifickou víczbou (do 2,7 %) . P r í I; 1 a d 2 Pádi o i.munoanalýzn alfafetoprotei nu (AFP) 100 ,ίΐ l specificko) protilátky proti AFP, 100 μΐ tlmivého roztoku pH 7,5, 100 /il12 5 [,-AFP a 100 μ 1 standardu (vzorky) sa -nechá inkubovať 18 hodin pri teplote 20 °C. K reakčnej zmesi sa potom přidá 500 pl suspenzie imobilizovanej zvieracej protilátky protikrái i.c lemu imunog1obu11 nu, pr i .pravenoj postupem uvedeným v příklade 1. Po premiešaní ainkubaci! I hodinu pri teplote 20 °C následuje krátká centrifugácia, odsatie supernatantua merun ie rád ioak ti v i. t y šedi mentu .

Tymto pontupom možno stanovit hodnoty AFP vo vzorkách krvného séra v rozsahu 6,25 až400 ru/Ml s vysokou citlivostou stanovenia (2 lU/ml) a velmi nízkou hodnotou nešpecifickejvazby (do 2 , 5 V,) . P r í k J a d 3 Rádioiinunočinalýza ty rog lobu línu (Tg) K 200 μ 1 standardu (neznámej vzorky séra) sa přidá 100 ^1 špecifickej protilátky proti tyroglobulínu. Po predinkubácii 3 h pri 37 °C sa do reakčnej zmesi přidá 100 μΐ Tg značené- ho jódom i 25 a zmes sa nechá stát cez noc pri 20 °c. Potom sa do každej skúmavky přidá 500 <ul precipitačného činidla, připraveného postupem uvedeným v příklade 1. Po inkubácii

Claims (2)

1. 4 20Í, 2,82 lil J. h pri 20 C a krátkej centri Iugúci i sa supernatant odsaje a zmeria sa radioaktivitasedimentu. llvi'11« ’ ným I íisl tipom možno slam-vil' h'>dn"»y I y i o <, i - 0 . 11 I í 1111 v krvhoni S''r'· v rozsahua z 6(10 /v,1 í · i l 1 i './os f < ni s 1 a i io ./< ai i , ι 5 / I , P r i k I a d Ί Pád i o i nnmo.i na I y t i. cké stanovenie aílalozínov v mlieku Do skiíniaviek sa pipetuje ρο Ϊ 00 μ] standardu ínuh.ivéto mlieku alebo neznánu? j vzorky),specificko} protilátky proti aflatoxínu M f a rádioind iká tóra (^"'l - ΛΕΙ,Λ Bj ) . Zanes sazamiesa a inkubuje cez noc pri 20 2 3C. Do skúmaviek sa potom přidá po 500 <ul přeci pitačnéhočinidla, připraveného postupom uvedeným v příklade 1 /s obsaho" 1 1 TWEENU 80). Reakčnázmes sa nechá inkubovať J h pri 20 °C, skámavky sa potom centrifugujú 10 minut pri 2 000 g,supernatant sa odsaje a zmeria sa radioaktivita sedimentu. Týmto postupom možno stanovit hodnoty aflatoxínov v mlíčku v rozsahu 0,062 5 až 2,0 <ug/ls citlivosťou stanovenia 0,05 /jg/J a variačnýrn koeficientom do 5,9 i, s nespecifickou vazboudo 5,5 Příklad 5 Pád ioi munoanalýza ochratoxinu Λ Ku 100 ^ul chloroformového extraktu zo vzorky krmivá, potraviny alebo tkaniva sa přidá] 25 100 (Hjl roztoku rádioindi k<á tóra ( 1-ochratoxin) a 100 ^ul specificko j protilátky protiochratoxínu Λ. Zmes sa inkubuje I hodinu pri 45 Do každej skámavky sa potom přidá po 500 ju l precipitučného činidla a dalším postupom, rovnakým ako v piedchádzajucich príkladoeh,možno stanovit hodnoty ochratoxínu Λ v extraktech z rastlinných .alebo živočišných vzoriekv rozsahu 10 až 320 mg/100 ýal s citlivostou stanovenia 8 mg/100 ^ij a variačnýrn koeficientomdo 5,7 %. PŘEĎME T V Y N Λ 1, E Z U

   1. Spósob rádioiinunochemického stanovenia antigénov s rožnou strukturou vyznačujáci sa tým, že ku specifické i protilátko, i.nkubovaiv? j vhodná dobu s roztokem jej antigénu znače-nému jódom 125 a neznámou vzor.kou príp. standaidom, sa přidává supsenz.ia imobilizovanej zvíeracej (s výhodou kozejí protilátky proti král idiomu imunoglobulínu vády v rovnakej koncentraci!a objeme bez chladu na stanovovaný druh antigénu. priconi po inkubaci! 1 h pri 20 C savzniknutý imunochemický komplex odstředí, zmeria sa jeho radioaktivita, pomocou ktorejmožno porovnáním s hodnotami standardov o známe i konoentrácii st anovit množstvo danéhoantigénu v neznámej vzorke.
2. 2. Spósob podlá bodu 1, vyznačujáci sa tým, že zvieracia protilátka proti králičiemu imunoglobulínu sa imobilizuje na povrchu modifikovanéj mikrokrystalickej celulózy s velkosťoučastíc 5 až 15 ^um majácích velmi nízku sedímentačnú rýchlosť, aktívovanej 1,1 -karbonyldiimid-azolom. Severografia, n. p., MOST Cena 2,40 Kčs