CS265536B1 - Subjednotková vakcfna proti rekurentnému herpesu a spósob jej přípravy - Google Patents

Abstract

Subjednotková vakcína proti rekurentnému herpesu je určená na imunoterapiu infekcií spósobených vírusom herpes simplex HS typu 1. Vakcína obsahuje specifické glykoproteíny, najma GB a BC z virusu herpes simplex HS typ 1 kmeňa HSZP, s výhodou z kmeňa IV SAS 02 až 60 a buňkové bielkoviny z buniek zárodkov japonských prepelíc s aktivitou 2 až 20 jednotiek antigenu na 1 uh proteinu. Spósob přípravy spočívá v tom, že sa primokultúra zárodkov japonských prepelíc po kultivácii infikuje kmeňom HSZP virusu herpes simplex HS typ 1, s výhodou kmeňom IV SAS 02 až 60. Infikované buňky sa inkubujú pri 36,5 až 37,5 °C, po dobu 18 až 22 hodin, pósobi sa na ne hypotonickým roztokom obsahujúcim neionogénny detergent a odstránia sa nukleokapsidy. Buňkový extrakt sa inaktivuje formaldehydom a nakoniec sa vakcína precipituje a čistí.

Description

265536 2

Vynález sa týká subjednotkovej vakcíny proti rekurentnému herpesu (oparu) určená naimunoterapiú infekčií spósobených vírusom herpes simplex typ 1 a spósobu jej přípravy.

Vynález rieši spósob přípravy subjednotkovej vakcíny tak, aby najjednoduchšou technológioua bez použitia vzácných chemikálií bol získaný vysoko imunogénny produkt.

Vakcíny z virusu herpes simplex (HS) možno rozdělit na živé a neživé. Neživé vakcínyz virusu HS možno rozdělit na 1. inaktivované virusové zmesi obsahujúce virusová DNA, 2.obalové virusové antigény (glykoproteíny) připravené z purifikovaných virusových častíc(viriónov), 3. subjednotkové vakcíny připravené z infikovaných buniek, 4. čisté virusovéglykoproteíny připravené metodou genetickej manipulácie. Posledně 3 druhy vakcín neobsahujúvirusová DNA, alebo by mali obsahovat menej ako 1 % póvodnej vírusovej DNA.

Inaktivované neživé vakcíny staršieho typu, ktoré obsahovali virusová DNA, bolí poodcentrifugovaní bunkovej drtě inaktivované formalínom a teplom (Benda, R. , Dbalý, V.: J. Hyg. Epidem.Microbiol. Immunol. 17, 237 až 244, 1973), formalínom (Rodovský, J. a spol.:Dermatol, Monatschr. 157, 701 až 709, 1971), ultrafialovým žiarením (Happel, R.: Arch.

Virol. 52, 29 až 35, 1976) alebo teplom (Nasemann, T.: Int. J. Dermatol. 15, 587 až 596, 1976). Niektoré vakcíny připravené inaktiváciou formalínom obsahovali oba 'typy virusu HS(Weitgasser, H.: Z. Hautkr. 52, 625 až 632, 1977) alebo zmes rozličných kmeňov oboch typov(tzv. polyvalentné vakcíny; Dundarov, S. a spol.: Standardization of Immunological Procedures,Develop, biol. Standars. 52, 351 až 358, 1982, S. Karger, Basel). Inaktivované vakcínaobsahujáca DNA sa vyrába aj komerčně pod názvom Lupidon Ή a Lupidon G (Hermal-Chemie, Comp.;Schmersahl, P. a Rúdiger, G.: Z Hautarzt 50, 105 až 112, 1975). Pre dokaž transformujúcehoúčinku áseku DNA virusu HS na cicavčie buňky (Rapp, F. a Duff, R.: Fed. Proč. 31, 1 661 až1 668, 1971) vyvstala otázka přípravy očkovacej látky, ktorá by neobsahovala virusová DNA. I ked vztah medzi karcinómom Čapíka maternica a vírusom HS-2 nebol jednoznačné preukázaný,všeobecne sa má zato, že subjednotková vakcína obsahujáca menej ako 1 % póvodnovej vírusovejDNA je pre pacienta omnoho bezpečnejšia ako inaktivovaný extrakt z infikovaných buniek.

Vakcíny připravené z purifikovaného virusu predpokladajá purifikáciu viriónov centrifu-govaním v gradiente sacharózy a následné opracovanie viriónov detergentom. Po zlúpnutívirusového obalu následuje separácia glykoproteínov virusového obalu od nukleokapsidovv gradiente sacharózy (Hilfenhaus, J. a Moser. H.: Behring Inst. Mitt. No 69, 45 až 56, 1981; Klein, R. a spol.: Arch. Virol. 68, 73 až 80, 1981; Hilfenhaus, J. a spol.: MedMicrobiol, Immunol. 169, 225 až 235, 1981; Thomson a spol.: infect. Immunity 41, 556 až562, 1983; Yoshino, K. a spol.: Microbiol. Immunol. 26, 753 až 757, 1982; Cappel, R. aspol.: Standard. Immunol. Precedures, Develop. biol. Standard. 52, 345 až 350, 1982; Cappel, R. a spol.: Arch. Virol. 73, 61 až 67, 1982).

Vakcíny obsahujáce glykoproteíny virusu HS bez vírusovej DNA je možné připravit ajz infikovaných buniek bez predchádzajácej purifikácie virusových častíc. Výhodou tohtopostupu je, že účinný antigén nezískamo iba z obalov virusových častíc, ale aj z membránové-ho systému infikovaných buniek. Rozhodujáce kroky postupu přípravy sa u rozličných autorovlíšia. Vakcína NFU (Skinner, G. R. B. a spol.: Med. Microbiol. Immunol. 166, 119 až 132, 1978) bola připravená po opracovaní buniek detergentom (Nonidet P-40), inaktivované forma-línom a centrifugovaná cez sacharózový vankúš pri vysokých obrátkách. V zásadě podobnábola metoda přípravy vakcíny, rozpracovaná v ÚSOL, Praha (Rutinová, V. a spol.: Acta virol. 21, 189 až 197, 1977; Rutinová, V. a spol.: Standard. Immunol, Procedures Develop, biol.Standard. 52, 313 až 319, 1982, S. Karger, Basel). Jej podstatou je opracovanie infikovanýchbuniek neiónnogénnym detergentom, centrifugovanie pri nižších obrátkách (odstránenie jadierbuniek) a potom pri vysokých obrátkách cez vankáš sacharózy. Pri tejto formě přípravy jeobalovanie nukleokapsidov vlastně nežiaduce, a preto sa přidává do výživného média chloridlitný, ktorý inhibuje aj syntézu vírusovej DNA ako aj obalovanie nukleokapsidov (Skinner, G. R. B. a spol.: Med. Microbiol, Immunol. 169, 39 až 47, 1980). lnou modifikáciou přípravy vakcíny z infikovaných buniek je opracovanie zraesou ditiotreitolu a formaldehydu s tvorbou membránových vezikúl, ktoré májá rozměry okolo 20 až 30/um (Thornton a spol.: Prod. Biologicals 3 265536

Develop. bíol. Standard, 50, 201 až 206, 1982).

Takto připravená vakcína obsahuje detergent, ktorý je potřebné odstránit, tiež žiadúceobohatit vakcínu o špecifické antigénové komponenty (virusové glykoproteíny), ktoré súpřítomné v zmesi s buňkovými proteínmi a glykoproteínmi. Na tieto účely slúži finálna úpravabuňkového extraktu. Kutinová, V. a spol. (1984) na finálnu úpravu použili afinitú chromatografiuna kolónke Con-A Sepharózy. lnou možnost je aplikácia kolonky šošovicového laktínu (Mertz, G. J. a spol.: J. Infect. Dis. 150, 242 až 249, 1984). Poměrně jednoduchým riešením jeprecipitácia proteínov buňkového extraktu acetónom.

Podstatou vynálezu je subjednotková vakcína proti rekurentnému herpesu obsahujúcazmes špecifických virusových glykoproteínov, najma GB a GC z virusu herpes simplex. HS typu1 kmeňa HSZP, s výhodou z kmeňa IV SAS 02 až 60 a buňkových bielkovín z buniek zárodkovjaponských prepelíc s aktivitou 2 až 20 jednotiek antigénu na lyug (mikrogram) bielkoviny.

Spósob přípravy tejto vakcíny spočívá v tom, že sa primokultúra buniek zo zárodkov japonskýchprepelíc (PEB) po kultivácii infikuje kmeňom herpes simplex HS typ 1 pasážovaný na buňkyzajačích plúc (HSZP), s výhodou kmeňom IV SAS 02 až 60, infikované buňky sa inkubujú pri36,5 až 37,5 °C po dobu 18 až 22 hodin. Potom sa na ne pósobí hypotonickým roztokom obsahujúcimneionogénny detergent a odstránia sa nukleokapsidy. Buňkový extrakt sa inaktivuje formal-dehydom, bielkoviny sa vyprecipitujú, s výhodou síranom amonným, do 35 až 75 % nasýteniaa nakoniec vyčistia, s výhodou dialýzovaním. Skratka PEB znamená prepeličie embrynálnebuňky.

Spósob přípravy subjednotkovej vakcíny podlá vynálezu má výhodu, že ako buňkový substrátvyužívá primokultúru zo zárodkov japonských prepelíc (PEB). Tieto buňky neobsahujú endogénneretrovírusy a nie sú kotaminované mykoplazmami. Ďalšou výhodou vynálezu je, že používákmen HSZP virusu HS typ 1 adaptovaný na kultúru kuřácích buniek a pasážovaný na buňky zajačíchplúc, ktorý sa velmi dobré rozmnožuje aj na buňkách zo zárodkov prepelíc. Finálna úpravavakcíny sa uskutočňuje jednoduchou precipitáciou síranom amonným. Tento spósob je v porovnanís afinitnou chromatografiou na lektínoch jednoduchý, účinný a lačný. V porovnaní s precipi-táciou acetónom je postup podlá vynálezu standardně reprodukovatelný a přitom šetrný, kedženedochádza k denaturácii glykoproteínov a získaný precipitát sa dobré rozpúšťa. Jednoduchosttýchto procedur umožňuje zachovat sterilitu. Z infikovaných buniek sa získá neinfekčný vysoko imunogénny produkt, ktorý je zmesouvirusových a buňkových bielkovín, prevážne glykoproteínov. Centrifugácia cez podušku sacharózyúčinné odstraňuje nukleokapsidy, takže vakcína obsahuje menej ako 1 % póvodnej vírusovejDNA vo formě nízkomolekulových fragmentov.

Kmen HSZP virusu herpes simplex HS typ 1 je uložený v zbierke Virologického ústavuSAV, Mlýnská dolina 1, 817 03 Bratislava pod číslom IV SAS 02 až 60.

Na přípravu buňkového substrátu sa úspěšně odskúšalo viacero druhov japonských prepelíc. Z hladiska výťažnosti je najlepší druh s imbrednou líniou Cl2 aguti (získaná z Výskumnéhoústavu pre chov a šlachtenie hydiny v Ivanke pri Dunaji). Přikladl Zárodky japonských prepelíc sa po odstránení hlavy drtia mechanicky a rozvolftujú v 0,1 % roztoku trypsinu. Získaná buňková suspenzia (PEB) sa nechá vyrásť v Roux flašách s objemom7 v v 1 200 ml (5x10 buniek na flašu, 80 ml kultivačného média TM SEVAC II. (Informacna službaSEVAC 167/612, Praha máj 1969). Buňky sa inkubujú v termostate pri 37 °C po dobu najmenej48 až 72 hodin. Morfologická kontrola V2hladu buniek sa robí inverzným mikroskopom. Buňkysa infikujú vírusom I-lS-l (kmeň HSZP) v dávke 0,25 PFU/bunku a inkubujú sa pri 37 °C 18 až22 h. Po infekcii sa urobí mikroskopická kontrola morfologie buniek: Ak sa zistí přítomnostmnohojadrových buniek, strata medzibunkových hraníc a zaokrúhlovanie buniek, médium sa 265536 4 odstráni a buňky sa premyjú fyziologickým roztokom (20 ml na Roux flašu). Všetky nasledujúce úkony sa robia pri 4 °C za sterilných podmienok. Buňky sa zoškrabujúdo roztoku retikulocytárneho pufru RSB 1/10 mM Tris-HCl pH7,5; 10 mM KCl; 15 mM MgCl2) doobjemu 2,5 až 3,0 ml na Roux flašu. Po spojení obsahu všetkých fliaš sa odoberie 0,1 mlbunkovej suspenzie na titrovanie obsahu virusu a přidá sa rovnaký objem roztoku (RBS IIRSB I obsahujúci 1 % neinogénneho detergentu (Nonidet P-40) a treo-1,4-dimerkapto-2,3-bután-diolu (ditiotreitol) v 2 mM koncentrácii). Po 10 minutách sa suspenzia centrifuguje zachladu pri 800xg 25 mínút. Supernant sa navrství na rovnaký objem 30 %-nej sacharózyv roztoku RSB I a centrifuguje sa pri 1000 OOOxg 3 h. Po centrifugácii sa supernatant oddělíod vrstvy sacharózy a přidá sa formaldehyd (1 ml formaldehydu riedeného destilovanou vodou1:10 na 100 ml supernatantu). K supernatantu sa přidává za neustálého miešania nasýtenýroztok síranu amonného (pH 7,0) do 60 %-ného nasýtenia. Vzniknutý precipitát sa nechá postaťdo nasledujúceho dňa, potom sa centrifuguje pri 2 OOOxg 20 minut, rozpustí v izotonickomfosfátovom tlmivom roztoku pH 7,2 a dialyzuje sa 3 dni pri najmenej troch výměnách difuzátu(poměr retentát - difuzát 1:100). Po dialýze voči destilovanej vodě a fyziologickému roztokusa stanoví obsah bielkovin. Roztok sa rozplní do ampuliek (1 mg proteinu na 1 ampulku) a polyofilizácii sa skladuje pri 4 až 8 °C. Příklad 2

Pri príprave šarže V37 a V39 bol postup ako v příklade 3 s tým rozdielom, že na precipi-táciu sa použil nasýtený roztok síranu amonného do 35 % nasýtenia. Příklad 3

Pri príprave šarže V42 bol postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že na precipitáciusa použil nasýtený roztok síranu amonného do 75 %-ného nasýtenia.

Príklad4

Pri príprave šarže V44 bol postup.ako v příklade 1, ale precipitácia síranom amonnýmdo 60 %-ného nasýtenia sa robila za chladenia pri teplota 0 až 4 °C (v ladovom kúpeli).

Stanovovali sa technické parametre vakcíny číslo šarže V31 vyrobenéj podlá příkladu 1.

Infikovalo sa 36 fliaš Roux 1 200 ml s vyrastenými buňkami PEB (20 až 30xl06 buniek/-flašu) dávkou 0,25 až 0,3 infekčných jednotiek (PFU) virus HSZP na buňku (2,4x10^ PFU).Výťažok za 22 h po infekcii bol 2,2x10^^ PFU (BOnásobok inokula). 2 toho infekčný titerbunkovej suspenzie bol 2χ10^*θ PFU (90 %· výtažku) . Objem extraktu po opracovaní detergentoma po centrifugácii bol 140 ml (140 mg proteinu). Po precipitácii síranom amonným sa získalo77 mg proteinu (77 ml), čo představuje 55 % póvodných bielkovin (1 mg/ml). Vakcína reagovalapizitívne v raketovéj imunoelektroforéze s králičím sérom proti víru HS kmeň KOS. V testeElisa s prasačou protilátkou na pevnej fáze vakcína reagovala do riedenia 12,5/Ug/m. V testo-vanom objeme 50/Ul přidalo 8 jednotiek antigénu na 1/ug bielkoviny. Vakcína bola imunogénnau morčiat, kde dve dávky po 300yug indukovali protilátky neutralizujúce virus v titri 1:64(v nepřítomnosti komplementu) a v titri 1:64 (v nepřítomnosti komplementu) a v titri 1:256(v přítomnosti komplementu).

Stanovili sa technické parametre šarže V37 podlá příkladu 2, kde sa získalo len 23 %-néhoproteinu z buňkového extraktu o vysokéj antigénnej účinnosti (18 jednotiek na l^ug bielkoviny)Pri šarži V38 pripravenej podlá příkladu 2 sa získalo 17 %-nej bielkoviny z buňkového extraktus vysokou antigénnou účinnost (10 až 20 antigénnych jednotiek na 1/ug proteinu). Obe šarževakcíny indukovali vysoké hladiny protilátok u morčiat (neutralizačný titer 1:28 a 1:256).

Stanovili sa parametre vakcíny šarže V42 podlá příkladu 3. Vakčína obsahovala 38 %-né

Claims (5)

1. 5 265536 bielkoviny z buňkového extraktu s antigénnou účinnosťou o niečo nižšou ako v příklade 2,ke&že na 1 /Ug bielkoviny připadali 2 jednotky antigénu. Dve dávky vakcíny {po 300/Ug namorča) indukovali u morčiat protilátky neutralizujíce virus v hladinách 64 až 256. Stanovili sa parametre vakcíny šarže V43 pripravenej podlá příkladu 4. Vakcína šaržeV43 obsahovala 37 %-nej bielkoviny buňkového extraktu a antigénová aktivita představovala 10 jednotiek na l^ug bielkoviny. Z príkladov vyplývá, že vakcína optimálnych vlastností v dostatočne velkom množstvebola získaná pri precipitácii za chladenia do 60 % nasýtenia, Vakcína proti rekurentnému herpesu je určená pre imunizáciu osób s často sa opakujícím(rekurentným) herpesom. Premorenosf populácie vírusom herpes simplex typ 1 (HS-1) v ČSSRje medzi 80 až 90 %, vírusom HS typ 2 (HS-2) okolo 30 %. Časté recidivy herpetických zmienna kozí alebo na slizniciach sa vyskytují s pravdepodobnostou 1:1 000, t. j. přibližné1 000 osób na milión obyvatelov trpí rekurentným herpesom. Zavedenie chemoterapie herpetickýchinfekcií rieši akítne obdobie primoinfekcie alebo recidivy, nemá však vplyv na už navodenúlatentnú infekciu, ani na vznik recidiv. Předpokládaným efektom vakcinácie je predlženieobdobia latencie medzi rekurenciami, teda zníženie počtu recidiv, alebo ich úplné vymiznutie,ako aj skrátenie doby hojenia recidivy. PREDMET VYNÁLEZU

   1. Subjednotková vakcína proti rekurentnému herpesu určená na imunoterapiu infekciíspósobených vírusom herpes simplex HS typu 1, vyznačující sa tým, že obsahuje specifickéglukoproteíny, najma G-B a B-C z virusu herpes simplex HS typ 1 kmeňa HSZP, s výhodou z kmeňa IV SAS 02 až 60 a buňkové bielkoviny z buniek zárodkov japonských prepelíc s aktivitou2 až 20 jednotiek antigénu na 1 ^ug proteinu.
2. 2. Spósob přípravy subjednotkovej vakcíny podlá bodu 1, spočívající v tom, že sa primo-kultíra zárodkov japonských prepelíc kultivuje za běžných podmienok, vyznačující sa tým, že sa infikuje kmeňom virusu herpes simplex HS typ 1 pasážovaný na buňky zajačích plic HSZP, s výhodou s kmeňom IV SAS 02 až 60, infikované buňky sa inkubujú pri 36,5 až 37,5 °C,po dobu 18 až 22 hodin, potom sa na ne pósobí hypotonickým roztokom obsahujícím neionogénnydetergent, odstrania sa nukleokopsidy a buňkový extrakt sa inaktivuje formaldehydom a nakoniecsa vakcína precipituje a čistí.
3. 3. Spósob prírpavy podlá bodu 2, vyznačující sa tým, že precipitácia sa robí síranomamonným do 35 až 75 % nasýtenia, pri teplote 0 až 20 °C, s výhodou pri 0 až 4 °C.
4. 4. Spósob přípravy podlá bodu 2 a 3, vyznačující sa tým, že po precipitácii sa vakcínačistí pomocou dialýzy.
5. 5. Spósob přípravy podlá bodu 1 a 4, vyznačující sa tým, že po čistění sa vakcínalyofilizuje.