CS265466B1 - Kmen mikroorganismu Candida lipolytica syn. Yarwinia lipolytica DBM 358 - Google Patents

Abstract

Kmen mikroorganismu Candida lipolytica syn. Yarwinia lipolytica DBM 358 produkující multienzymový systém s obsahem oxidoreduktas a lipas.

Description

Vynález se týká nového mutantního kmene kvasinek druhu Candida lipolytica syn. Yarowia lipolytica, vhodného pro produkci multienzymového systému přednostně odbourávajícího uhlovodíky s delším uhlíkatým řetězcem Cg až ^C35 a lipidy.

Řada mikroorganismů, bakterií, kvasinek a plísní syntetizují enzymy, odbourávající delší uhlíkaté řetězce, při kultivaci na médiu s vhodným induktorem této enzymové aktivity, tzn. vhodným uhlovodíkem. Nejsnáze asimilovatelnými uhlovodíky jsou alkány s lineárním řetězcem C.„ až C_1O. Odbourávání je uskutečňováno systémem oxidoreduktas, které převádějí uhlo 1 U 1 o vodíky na alkoholy, aldehydy a karboxylové kyseliny.

Lipolytická aktivita byla popsána u některých bakterií (rod Pseudoraonas), kvasinek (Lipomyces, Candida, Cryptococcus, Rhodotorula) a plísní (Oospora). Při enzymovém rozkladu tuků vznikají mastné kyseliny a alkoholy.

Kvasinky Candida lipolytica syn. Yarwinia lipolytica produkují na živném médiu, v kterém jsou zdrojem uhlíku alkány a ztužený tuk, multienzymový komplex s oběma typy enzymů. Aktivita tohoto multienzymového komplexu je u rodičovského kmene nízká a optimální podmínky pro jejich působení jsou 30 °C a pH 6. Růst kmene na médiu s alkány a ztuženým tukem jako jediným zdrojem uhlíku a energie je pomalý a maximální produkce enzymu je dosaženo po 4 až 5 dnech kultivace. Například pro potřebu pracích prostředků je nutný enzymový systém pracující při vyšších pH a teplotě.

Tyto nedostatky rodičovského kmene odstraňuje kmen Candida lipolytica podle vynálezu, který je uložen ve sbírce kvasinek na katedře biochemie a mikrobiologie VSCHT Praha, pod číslem DBM 358. Kmen DBM 358 má zachované morfologické vlastnosti rodičovského kmene, avšak produkuje ve zvýšené míře multienzymový komplex vhodný pro odbourávání uhlovodíků s delším uhlíkatým řetězcem a lipidů. Optimální podmínky působení tohoto komplexu jsou při teplotě 50 až 60 °C a pH 8 až 11. Vykazuje vyšší aktivitu oxidoreduktas i lipas o 80 až 90 % resp.

až 90 % oproti rodičovskému kmenu. Dále produkuje tento mutantní kmen oxidasový komplex, který obsahuje nejméně z 50 % alkan hydroxylasovou aktivitu nezávislou na NADH.

Pro produkci tohoto enzymového komplexu potřebuje kmen DBM 358 prostředí obsahující N-alkany, ztužený tuk (NH₄)₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄.7H₂O, K₂SO₄, kvasničný extrakt.

Kmen Candida Lipolytica DBM 358 byl získán opakovaným působením UV záření a N^-methyl-N-nitrosomočoviny na kmen Candida lipolytica a opakovanou selekcí získaných mutantů.

Nakultivované buňky rodičovského kmene asepticky odstředěné, dvakrát promyté sterilním fosfátovým tlumivým roztokem pH 7, byly resuspendované a naředěné stejným tlumivým roztokem tak, aby výsledná koncentrace buněk byla 10^ b/ml. 5 ml této suspenze bylo ozářeno UV svět2 lem po dobu 20, 30, 60, 120 a 180 s, což odpovídá dávkám záření 36, 54, 108, 216 a 324 J/m . Ozářené suspenze byly naředěny a rozetřeny na agarové plotny s kompletním médiem v množství 0,1 ml. Po třídenní inkubaci při 30 -°C byla provedena isolace kmenů a jejich selekce na agarových plotnách s n-alkany a lipidy. Vybraný nejaktivnější kmen (dávka 108 J/m ) byl 2 opakovaně podroben účinkům UV záření. Kmen UV 60/2 isolovaný z dávky 216 J/m byl vystaven mutagennímu zásahu N'-methyl-N-nitrosomočoviny. K suspenzi buněk, získaných obdobným způsobem g jako při aplikaci UV zářením o koncentraci 1x10 b/ml, bylo přidáno 8 mg N'-methyl-N-nitrosomočoviny na 10 ml suspenze buněk. Po 60minutové inkubaci při 28 °C na reciproké třepačce byly buňky odstředěny, promyty a přidány k 8 ml minerálního média s n-alkany. Po třídenní kultivaci byla horní alkanová vrstva s buňkami využita jako inokulum pro další inkubaci.

Tento postup byl zopakován 3krát. Po skončeni kultivace byly buňky asepticky odstředěny, promyty a převedeny na bramborový agar. Kolonie, které narostly po dvou až třídenní kultivaci byly izolovány. Z takto ošetřených buněk byl isolován kmen DBM 358.

Kmen DBM 358 má zachované morfologické vlastnosti rodičovského kmene. Tvoři oválné buňky o rozměrech (3 až 5)x(5 až 11) ^u. Je charakteristický tvorbou pseudomycelia. Rozmnožuje se multilaterálním pučením. Nárůst na agarové půdě je krémově zbarvený s viditelně zvrásněným povrchem. Kmen nemá kvasné schopnosti, asimiluje glukosu, ethanol, glycerol, erythritol, kyselinu citrónovou a DL-mléčnou. Slabě asimiluje L-sorbosu a D-manitol. Neasimiluje ϊ^ΝΟ^.

Na rozdíl od rodičovského kmene produkuje ve zvýšené míře multienzymový komplex vhodný pro odbourávání uhlovodíků s delším uhlíkatým řetězcem a lipidů.

Příklad

Kmen Candida lipolytica DBM 358 se kultivuje 24 hodin na tekutém médiu s obsahem glukosy 1 % hmot., kvasničného outolysatu 0,5 % hmot., peptonu 0,3 % hmot., hydrolyzátu kaseinu 0,5 % hmot. při teplotě 28 °C za třepání a poté se 5 až 10 % hmot. takto připraveného inokula převede do média obsahujícího 0,5 až 2,5 % hmot. alkánů 0,5 až 3 % hmot. ztuženého tuku,

0,1 až 0,2 % hmot. (NH^^HPO^, 0,25 až 0,35 % hmot. (NH^^SO^, 0,01 až 0,03 % hmot. MgSO^.7H^O, 0,5 až 0,1 % hmot. í^SO^, 0,01 až 0,02 % hmot. kvasničného extraktu. Kultivace probíhá 48 až 96 hodin při teplotě 25 až 37 °C. Po ukončení kultivace se biomasa kvasinek separuje odstředěním a promyje se několikrát destilovanou vodou. Takto připravené buňky vykazovaly následující aktivity: lipolytická aktivita dosahovala hodnot od 10 do 50 U/mg bílkovin, oxidoreduktasová aktivita od 1 do 3,5 nkat/mg bílkoviny v závislosti na zdroji uhlíku v kultivačním médiu.

Ve srovnání s tím, rodičovský kmen za stejných podmínek kultivace vykazoval lipolytickou aktivitu od 2 do 30 U/mg bílkovin, oxidoreduktasová aktivita od 0,1 do 2 nkat/mg bílkovin.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Kmen mikroorganismu Candida lipolytica syn. Yarwinia lipolytica DBM 358, produkující multienzymový systém s obsahem oxidoreduktas a lipas.