CS264456B1

CS264456B1 - Způsob výroby 5,6-dihydro-S-azacytidinu

Info

Publication number: CS264456B1
Application number: CS876306A
Authority: CS
Inventors: Alois Rndr Csc Piskala; Barbara Cesnekova; Jiri Drsc Vesely
Original assignee: Piskala Alois; Barbara Cesnekova; Vesely Jiri
Priority date: 1987-08-28
Filing date: 1987-08-28
Publication date: 1989-08-14
Also published as: CS630687A1

Abstract

Řešení se týká nového způsobu výroby 5,6-dihydro-5-azacytidinu redukcí 5-azacitidinu práškovým zinkem v prostředí bezvódé karboxylové kyseliny. Vyráběná látka vykazuje protinádorový účinek.

Description

Vynález se týká způsobu výroby 5,6-dihydro-5-azacytidinu vzorce I

který lze převést běžným způsobem na adiční sůl s netoxickou anorganickou či organickou kyselinou. *

5.6- dihydro-5~azacytidin vzorce I je analogem cytidinu, od něhož se dá formálně odvodit záměnou skupiny CH v poloze 5 pyrimidinového jádra isoelektronickým atomem dusíku a následovnou adicí vodíku na dvojnou vazbu v poloze 5,6 triazinového kruhu. Dihydroderivát vzorce I je ná rozdíl od 5-azacytidinu stabilní ve vodných roztocích v širokém rozmezí pH a je také podstatně lépe rozpustný ve vodě.

5.6- dihydro-5-azacytidin vzorce I, používaný běžně ve formě hydrochloridu, je fosforylován uridin-cytidinkinasou z L1210 a HeLa buněk, třebaže méně účinně než 5-azacytidin (b. Fi.terman a spol.: Biochem. Pharmacol. 27, 907 (1978)] . Je také inkorporován do jaderné

RHA buněk L1210 na stejné nebo vyšší úrovni než 5-azacytidin (R. GLazer a spol.: Mol. Pharmacol. 17, 111 (1980)) . Studie účinků dihydroerivátu vzorce I na expresi genů nazančují, že tento nukleosid je také inkorporován do DNA a inhibuje methylaci DNA, třebaže jeho účinnost je nižší než v případě 2'-deoxy-5-azacytidinu. Původně se předpokládalo, že mechanismus účinku dihydroderivátu vzorce I je podobný jako u 5-azacytidinu (r. Glazer a spol.: Mol. Pharmacol. 17, 250 (1980{) . Avšak současný výzkum naznačuje, že biochemický podklad cytotoxic kého účinku těchto nukleosidů může být zcela odlišný (j. M. Covey a spol.: Canoer Res.

46, 5 511 (1986^. Novější poznatky o mechanismu biologického působení 5,6-dihydro-5-azacytidi nu vzorce I jsou shrnuty v přehledném referátu (J. Veselý: Pharmac. Ther. 28, 227 (1985)) .

5,6-dihydro-5-azacytidin vzorce I vykazuje reprodukovatelnou aktivitu proti myší L1210 a P388 leukémii. Je také účinný proti buňkám lidského mamárního karcinomu MX-1, transplantova ného athymickým myším. Dále je látka účinná proti myšímu mamárnímu karcinomu CD8F a podkožně implantovanému nádoru tlustého střeva 38. Dihydroderivát vzorce 1 byl také podroben klinickým zkouškám (g. A. Curt a spol.: Cancer Res. 45, 3 359 (1985)) .

Hydroohlorid 5,6-dihydro-5-azaoytidinu vzorce I byl poprvé připraven redukcí 5-azacytidi nu borhydridem sodným a následnou kyselou hydrolýzou získaného komplexu s boritou kyselinou v celkově 67% výtěžku (j. A. Beisler a spol.: J. Med. Chem. 20, 806 (1977)) ; USA pat. č. 4 058 602). Volný dihydroderivát vzorce I byl uvedenými autory získán z jeho hydrochloridu v dobrém výtěžku působením vodného amoniaku nebo, taktéž v dobrém výtěžku, použitím silně basického anexu v OH~ formě.

Uvedená příprava dihydroderivátu vzorce I je poměrně zdlouhavá, používá dosti drahého redukčního činidla a také celkový výtěžek je poměrně nízký, což z výrobního hlediska představuje vzhledem k vysoké ceně výchozího 5-azacytidínu značné ztráty. Podrobným výzkumem chemické redukce 5-azacytidinu bylo zjištěno, že se tato reakce dá provést v krátké době a téměř beze ztrát použitím práškového zinku v bezvodé octové kyselině. Produkt se dá ve formě soli s octovou kyselinou zachytit na sloupci silně kyselého katexu v NH^ formě a po vymytí octanu amonného vodou se látka uvolní ze sloupce zředěným roztokem vodného amoniaku. Takto byl dihydroderivát vzorce I získán ve velmi čisté formě a v konsistentně vysokých výtěžcích (94 až 99 %). 5,6-dihydro-5-azacytidin (X) se dá výhodně připravit také redukci 2',3',5'-tri-O-acyl-5-azacytidinu práškovým zinkem v octové kyselině a následným odstraněním chránících skupin získaného 2',3',5'-tri-0-acyl-5,6-dihydro-5-azacytidinu, nebo jeho adiční soli s organickou či anorganickou kyselinou, methanolýzou. Touto strategií se zabrání ztrátám (20 až 30%) , ke kterým dochází již při výrobě nestálého 5-azacytidinu z jeho 2',3',5'-tri-O-acylderivátu. Ztráty při odstraňováni acylových skupin z 2,3',5'-tri-O-acyl-5,6-dihydro-5-azacytidinu jsou vzhledem ke stabilitě tohoto nukleosidu podstatně menší.

Podstata způsobu výroby 5,6-dihydro-5-azacytidinu vzorce I podle vynálezu spočívá v tom, že se volný nebo blokovaný 5-azacytidin obecného vzorce II

NH,

Λ

SA

ROCHy zO (II),

Π

RO OR kde R je vodík nebo acyl, redukuje práškovým zinkem v bezvodé karboxylové kyselině s 1 až 4 atomy uhlíku a v případě použití sloučeniny vzorce II, kde R je acyl, se vzniklý 2',3*,5' -tri-O-acyl-5,6-dihydro-5-azacytidin obecného vzorce III

(III), uckou kyselinou, podrobí kde R je acyl, případně jeho adiční sůl s organickou či .c:· alkoholýze a získaný 5,6-dihydro-5-azacytidin vzorce I se v případě potři·! ·,.' převede běžným způsobem na adiční sůl s netoxickou anorganickou či organickou kyselinou.

Redukce probíhá velmi rychle již při teplotě místnosti za použití pěti až desetinásobku teoretického množství práškového zinku. Reakce probíhá pomaleji i při nižších teplotách. Použití vyšších teplot vede v důsledku částečné degradace triazinového jádra ke snižování výtěžků. Isolaoe volného dihydroderivátu vzorce I se provádí s výhodou ionexovou technikou. Jako karboxylové kyselina se osvědčila komerčně dobře dostupná kyselina octová. Jelikož blokovaný 5-azacytidin je citlivější vůči hydrolýze než volný 5-azacytidin, je vhodné redukci blokovaných nukleosidu provádět ve směsi karboxylové kyseliny a 2,2-dimethoxypropanu, který zaručuje bezvodnost reakčního prostředí. Isolace blokovaného nukleosidu vzorce III se provádí s výhodou vytřepáváním do chloroformu a převedením na adiční sůl s organickou či anorganic kou kyselinou.

Alkoholýza 2',3’,5'-tri-O-acyl-5,6-dihydro-5-azacytidinu, vzorce III, případně jeho adiční soli s anorganickou nebo organickou kyselinou, se provádí roztokem alkoxidu alkalického kovu v alkanolu s 1 až 6 atomy uhlíku, s výhodou methoxidem sodným v methanolu.

V dalším je vynález blíže objasněn v příkladech provedení, aniž se na tyto jakkoliv omezuje.

Přikladl

Příprava acetátu 2',3',5'-tri-O-benzoyl-5,6-dihydro-5-azacytidinu

Směs kyseliny octové (5 ml) a 2,2-dimethoxypropanu (2 ml) se ponechá 24 hodin stát při teplotě místnosti v uzavřené baňce. Pak se přidá postupně práškový zinek (0,65 g) a 2',3',5'-tri-0-benzoyl-5-azacytidin (0,556 g; 1 mmol). Směs se 2,5 hodiny intensivně magne264456 ticky míchá při teplotě místnosti a odsaje přes fritu. Materiál na fritě se promyje postupně kyselinou octovou, methanolem a bohatě směsí chloroform.methanol (9:1). Spojené filtráty se vytřepou postupně vodou a 5% roztokem kyselého uhličitanu sodného. Organická vrstva se po vysušení (MgSOp a přidání kyseliny octové (0,1 ml) odpaří ve vakuu. Krystalizací zbytku ze směsi methanol-petrolether se získá po zpracování matečných louhů celkem 0,515 g (85%) acetátu 2',3',5'-tri-0-benzoyl-5,6-dihydro-5-azacytidinu; t.t. 132 až 136 °C (rozklad).

Příklad 2

Příprava hydrochloridu 2',3',5'-tri~0-benzoyl-5,6-dihydro-5-azacytidinu

2',3',5'-tri-0-benzoyl-5-azacytidin (0,356 g; 1 mmol) se podrobí redukci postupem dle příkladu 1. Ke chloroformovému roztoku surového produktu se přidá 0,7% roztok chlorovodíku v methanolu (5 ml) a vyloučený produkt se po hodinovém stání při teplotě místnosti odsaje a promyje chloroformem. Získá se 0,516 g (86,7%) hydrochloridu 2', 3',5'-tri-0-benzoyl-5,6-dihydro-5-azacytidinu; t.t. 254 až 259 °C (rozklad).

Přiklad 3

Příprava 5,6-dihydro-5-azacytidinu

Směs acetátu 2',3',5'-tri-0-benzoyl-5,6-dihydro-5-azacytidinu (0,309 g; 0,5 mmol), methanolu (3 ml) a methanoliokého lM-NaOCH^ (1 ml) se 24 hodin magneticky míchá při teplotě místnosti. Směs se okyselí kyselinou octovou (0,1 ml) a odpaří ve vakuu. Zbytek se promyje petroletherem a rozpustí ve vodě. Roztok surového produktu se nanese na sloupec silně kyselého katexu v NH^ formě (10 ml) a sloupec se promyje vodou (150 ml). Produkt se ze sloupce vymyje ÍM-NH^OH (75 ml) a eluát se odpaří ve vakuu při 35 až 40 °C (teplota lázně). Krystalizací zbytku ze směsi methanol-voda-ether se po zpracování matečných louhů celkem získá 0,110 g (89,5%) 5,6-dihydro-5-azacytidinu; t.t. 217 až 221 °C (rozklad).

Přikládá

Příprava 5,6-dihydro-5-azacytidinu

Hydrochlorid'2',3',5'-tri-0-benzoy1-5,6-dihydro-5-azacytidinu (0,298 g; 0,5 mmol) se methanolýzuje postupem dle příkladu 3. Získá se celkem 0,112 g (91%) 5,6-dihydro-5-azacytidinu; t.t. 217 až 221 °C (rozklad).

Příklad 5

Příprava 5,6-dihydro-5-azacytidinu

Směs 5-azaoytidinu (4,88 g; 0,02 mmol), kyseliny octové (100 ml) a práškového zinku (13 g) se 24 hodin magneticky míchá při teplotě místnosti. Nerozpustný podíl se odsaje a promyje postupně kyselinou octovou a bohatě methanolem. Spojené filtráty se odpaří ve vakuu při 35 až 40 °C (teplota lázně) , zbytek se rozpustí ve vodě a roztok nanese na sloupec silně kyselého kacexu v NH^* formě (110 ml) a sloupec se promyje vodou (1 500 ml). Produkt se vymyje 1M-NH^OH (750 ml) a eluát se odpaří ve vakuu při 35 až 40 °C (teplota lázně). Krystalizací zbytku ze směsi methanol-voda-ether se po zpracováni matečných louhů celkem získá 4,56 g (93,5%) 5,6-dihydro-5-azacytidinu; t^t. 216 až 221 °C (rozklad). Poslední matečný louh se nanese na sloupec slabě basického anexu v OH formě (20 ml), látka se vymyje vodou (200 mml) a eluát se odpaří ve vakuu. Krystalizací zbytku z uvedené směsi rozpouštědel se získá dalších 0,250 g (5,1%) produktu; t.t. 216 až 221 °C (rozklad).

Příklad 6

Příprava hydrochloridu 5,6-dihydro-5-azacytidinu

Roztok 5,6-dihydro-5-azacytidinu (2,46 g; 0,01 mol) ve vodě (100 ml) se neutralizuje 1N-HC1 (10 ml) a odpaří ve vakuu při 35 až 40 °C (teplota lázně). Krystalizací zbytku z methanolu se ve třech podílech získá celkem 2,69 g (95,2%) hydrochloridu 5,6-dihydro-5-aza cytidinu; t.t. 185 až 189 °C (rozklad).

Claims

1. Způsob výroby 5,6-dihydro~5-azacytidinu vzorce I nh₂

HOCH·,

HO OH a jeho adíčních solí s netoxickými anorganickými či organickými kyselinami, vyznačený tím, že se volný nebo blokovaný 5-azacytidin obecného vzorce II

ROCH (II).

kde R je vodík nebo acyl, redukuje práškovým zinkem v bezvodé karboxylové kyselině s 1 až 4 atomy uhlíku a v případě použití sloučeniny obecného vzorce IX, kde R je acyl, se vzniklý 2', 3' , 5'-tri-O--acyl-5,6-dihydro-5-azacytidin obecného vzorce III (III) , kde R je acyl, případně jeho adiční sůl s anorganickou či organickou kyselinou, podrobí alkoholýze a získaný 5,6-dihydrc-5-azacytidin vzorce I se v případě potřeby převede na adiční sůl s netoxickou anorganickou či organickou kyselinou.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se redukce sloučeniny obecného vzorce II provádí pěti až desetinásobkem teoretického množství práškového zinku v prostředí kyseliny octové při teplotě místnosti.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se redukce sloučeniny obecného vzorce II, kde R je acyl, provádí v přítomnosti nadbytku 2,2-dimethoxypropanu.

4. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se 2',3',5'-tri-O-acyl-5,6-dihydro-5-azacytidinu, obecného vzorce III isoluje ve formě adiční soli s anorganickou či organickou kysělinou, s výhodou ve formě adiční soli s chlorovodíkem nebo kyselinou octovou.

5. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se alkoholýza sloučeniny obecného vzorcem, případně její adiční soli s anorganickou nebo organickou kyselinou, provádí roztokem alkoxidu alkalického kovu v alkanolu s 1 až 6 atomy uhlíku, s výhodou methoxidem sodným v methanolu.