CS263173B1 - Určovanie homologických úsekov nukleových kyselin - Google Patents

Description

263273 2

Vynález sa týká sposůbu určovania přítomnosti homologických úsekov nukleových kyselin,najčastejšie génu na chromozóme.

Doposial sa přítomnost génu na chromozóme najčastejšie vyšetřuje pomocou radioaktivněznačených sond tak, že sa vyšetřovaná deoxyribonukleová kyselina rozstřihá na malé úsekypomocou restrikčných endonukleáz. Fragmenty sa rozdelia pomocou elekttoforézy a prenesúna filtračný papier.Takto získaná vzorka sa premiestni do prostredia s radioaktivně znače-nými sondami. V hybridizačnom procese sa sondy naviažu na komplementárny úsek deoxyribonuk-leovej kyseliny azaznamenajú na fotograficky citlivej vrstvě radioaktívny úsek. Iný známyspůsob mapovania génov vychádza z chromozómov získaných po kultivácií základným postupom.

Na ne sa působí ribonukleázou a následuje proces hybridizácie so sondami, působenie strieb-ra a znovu zaznamenanie na fotocitlivú vrstvu. Zobrazia sa chromozómy i lókusy s přítomnýmgénom. Nevýhodou je nlekoíkodňové spracovanie, finančné náklady, pracovná náročnost, manipu-lácia s radioaktívnymi látkami, ich krátký polčas rozpadu.

Uvedené nevýhody odstraňuje spůsob určovania přítomnosti homologických úsekov nukleovýchkyselin, najčastejšie génu na chromozóme, ktorého podstata spočívá v tom, že sa k reakčnémusystému obsahujúcemu na nosiči, například nitrocelulóze, nylone fixovanú vyšetrovanú jedno-vláknovú nukleovú kyselinu a sondu samotnú, popřípadě zabudovanú.do dvojvláknovej vektorovejnukleovej kyseliny, přidá Specifická DNA-protilátka a urobí sa vyhodnotenie, napříkladpřidáním substrátu za vytvorenia farebnej reakcie. Výhody navrhovaného spůsobu vynálezu sú v tom, že umožňuje nahradit prácu s radioaktív-nými látkami s enzymatickým značením, znižuje pracnost postupu, umožňuje vyšetrovanie génovu heterozygótov v medicíně, mikrobiologickú diagnostiku i pri biotechnologických postupoch.Znižuje finančné náklady.

Na připojených výkresoch sú znázorněné příklady postupu pri zistovaní homologickýchúsekov nukleových kyselin. Na obr. 1 a 2 je znázorněný přiklad s využitím sondy vo formějednovlákna. Na obr. 3 je znázorněný spůsob s použitím komplexu jednovláknovej sondynukleovej kyseliny a dvojvláknovej nukleovej kyseliny. Sonda sa bud přidá k fuxovanejvyšetřovanéj nukleovej kyselině obr. 1, 2, 3, alebo je fixovaná sonda a přidá sa dinaturovanánukleová kyselina obr. 4. Příklad 1

Neznáma nukleová kyselina .1 sa vo formě jednovlákna fixuje na nosiči 2 a přidá sasonda 3. V mieste komplementárneho úseku dojde k hybridizácií a vytvoří sa dvojvlákno 4. Na vzorku sa působí Specifickou protilátkou proti dvojvláknovej nukleovej kyselině 5,protilátka může byť značená například radionuklidami obr. č. 1, alebo sa použije neznačenáprotilátka obr. č. 2. Naviazanie neznačenaj protilátky na dvojvlákno nukleovej kyseliny4_ sa potvrdí přidáním značenej protilátky ý proti špecifickej protilátke 5. Příklad 2

Neznáma nukleová kyselina sa vo formě jednovlákna fixuje na nosiči 2, přidá sa sonda2, v mieste komplementárneho úseku sa vytvoří dvojvlákno 4. Na vzorku sa působí enzymatickyznačenou Specifickou protilátkou proti dvojvláknovej nukleovej kyselině 5: Po naviazaníprotilátky 5 na sondu 3 a dvojvlákno 4 sa přidá substrát 8. Výsledok reakcie 7 sa odčítá. Příklad 3

Sodná 2 sa fixuje na nosiči 2, přidá sa neznáma nukleová kyselina K V rozsahu homo-logického úseku nukleových kyselin sa vytvoří dvojvlákno _4» na vzorku sa působí enzymatickyznačenou protilátkou Přidá sa substrát jí a výsledok reakcie sa odčítá 7.

Claims (3)

3 263173 Příklad postupu: Denaturovaná jednóvláknová deoxyribonukleová kyselina _1 sa prenesie na nitrocelulózovýfilter 2 v množstve 5 až 30 ul, ten sa ponechá vo vákuu pri teplote 80 stupňov Celziana 2 hodiny. Potom nastúpi hybridizácia s předurčenou sondou 2 v množstve 1 až 1 000 ng/mlna 3 až 20 hodin v hybridizačnom pufre za přítomnosti 45 až 55 % formamidu a teplote42 stupňov Celzia. Použitá sonda představuje jednovláknový úsek nukleovej kyseliny. Máschopnost hybridizovat s neznámou kyselinou v mieste, ktoré má komplementárně usporiadaniebáz /Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982/. Móže sa použit sonda vo formě jednovlákna, alebo vo formě komplexu, kde jedno-vlákno tvoří Specifický úsek a ostatná část móže byť tvořená dvojvláknom. Príkladom jejednovláknový úsek, ktorý je súčastou vektora /Hu nad Messing, Gene, 17. 271 až 277, 1982/.Vektor je malá část dfeoxyribonukleovej kyseliny, ktorá slúži ako nosič cudzorodej DNA,móžu to byť fágy, plazmidy a iné. Po hybridizácií dojde v mieste homologických úsekov ,k vytvoreniu dvojvlákna 4 nukleových kyselin. Vzorka sa přeplácíme a nechá působit mono-klonálna protilátka 5 proti dvojvláknovej nukleovej kyselině i, jej schopnost viazaťsa len na dvojvláknové Struktúry vytvoří komplex. Naviazanie možno dokázat tak, že saprotilátka'označí. Výhodné sa používá enzymatické 5, alebo radioizotopami 6. Pri značeníprotilátky enzýmom 5 sa naviazanie protilátky na sondu 3 dokáže pomocou substrátu fi. Substrát 8 je reaktant pri reakcií katalyzovanej enzýmom. Pre protilátku značenú alkalickoufosfatázou, móže pozostávat z'0,33 mg nitrotetrazoliovej modré a 0,17 mg 5-bromo-4-chloro--3-indolylphosphatu na mililiter rozpuštěný v 100 mM Tris HC1 - 0,1 M NaCl - 5 mm MgCl2/Leary, J. J., D. J. Brigati, and D. C. Ward, Proč. Nati, Acad. Sci. USA 80: 4 045 až4 049, 1983/. Po jeho přidaní dojde k vytvoreniu farebnej reakcie 2· Výsledok sa móžeodčítat. Možnost použitia je v medicíně humánněj i veterinárněj, pri určovaní přítomnostigénu na chromozome, v biotechnologických postupoch, pri mikrobiologickéj diagnostiky,pri hladaní homologických úsekov nukleových kyselin v oblasti evolučných súvislosti organyzmov. PREDMET VYNALEZU

1. SpÓsob určovania homologických úsekov nukleových kyselin, například génu na chomozóme,pri ktorom sa najprv dvojvláknová nukleová kyselina denaturuje na jednovláknovú nukleovúkyselinu, na ktorú sa pósobí sondou obsahujúcou aspoň 8 baží, vyznačený tým, že sa k reakčnémusystému obsahujúcom na nosiči, například nitrocelulóze, nylone fixovanú vyšetrovanú jedno-vláknovú nukleovú kyselinu a sondu samotnú, popřípadě zabudovanú do vektorovej nukleovejkyseliny přidá Specifická DNA-protilátka a urobí sa vyhodnotenie, například přidáním substrátuza vytvorenia farebnej reakcie.

2. SpÓsob podlá bodu 1 vyznačený tým, že sa do reakčného systému.přidá značná protilátkaSpecifická proti DNA-protilátke a urobí sa vyhodnotenie.

3 výkresy