CS258362B1 - Způsob kvantitativního stanoveni alfa-laktalbuminu v tělních tekutinách a vodných roztocích - Google Patents

Abstract

Očelem řešeni je kvantitativní stanovení alfa-laktalbuminu v tělních tekutinách nebo vodných roztocích v koncentračním rozsahu 0 až 200 ,ug/l. Dosahuje se ho tím, že alfa-laktalbumin obsažený v tělní tekutině nebo ve vodné roztoku se uvede do kontaktu s protilátkou proti alfa-laktalbuminu, sorbovanou na pevný nosič, z něhož byl nadbytek nenasorbované protilátky odstraněn vymýváním. Na vytvořený imunokomplex je po opakovaném promytí pevného nosiče navázána protilátka proti alfa-laktalbuminu značená enzymem. Po odstraněni jejího nezreagovaného podílu se stanoví koncentrace enzymu, která je přímo úměrná koncentraci alfa-laktalbuminu. Řešení je využíváné v oboru klinické biochemie pro stanovení koncentrace alfa-laktalbuminu v séru nebo jiných tělních tekutinách, především u onkologických nemocných.

Description

Vynález se týká způsobu kvantitativního stanovení alfa-laktalbuminu v tělních tekutinách a ve vodných roztocích.

Účelem vynálezu je stanovit alfa-laktalbumin v koncetracích, které se vyskytují v lidském séru, eventuálně v jiných tělních tekutinách (mléko, cystická tekutina prsu) nebo extraktech tkání. Stanovení této bílkoviny specificky syntetizované v mléčné žláze se uplatňuje především při studiu procesu vývoje rakoviny mléčné žlázy.

Je známý způsob kvantitativního stanovení alfa-laktalbuminu v tělních tekutinách metodou radioimunostanovení (K. L. Woods, D. H. Cove, J. M. Morrison, D. A. Heath: Eur. J. Cancer 15 (1979) 47-51). Nevýhodou tohoto způsobu je kompetitivní princip stanovení, kdy interferující složky ze vzorku (séra) je třeba předem odstranit vysrážením. Další nevýhodou je omezení této metody pouze na laboratoře se speciálním a nákladným přístrojovým vybavením, neméně závažné je i možné riziko kontaminace radionuklidy.

Výše uvedené nedostatky řeší metoda kvantitativního stanovení alfa-laktalbuminu v tělních tekutinách a vodných roztocích podle vynálezu, jejíž podstata spočívá v tom, že tělní tekutiny nebo vodný roztok obsahující alfa-laktalbumin se uvede do kontaktu s protilátkou proti alfa-laktalbuminu sorbovanou z roztoku o koncentraci 0,1 až 20 mg/1 při teplotě 4 až 40 °C po dobu 1 až 72 hodin na pevný nosič, s výhodou na stěny jamek polystyrénové destičky, zbavené opakovaným vymýváním nenasorbované protilátky proti alfa-laktalbuminu a nechá se reagovat za teploty 20 až 40 °C po dobu 1 až 5 hodin za vzniku imunokomplexu, načež po opětném opakováném promývání pevného nosiče se sorbovaný imunokomplex nechá reagovat s vodným roztokem protilátky proti alfa-laktalbuminu značené enzymem, o koncentraci bílkoviny 0,1 až 20 mg/1, a to po dobu 1 až 5 hodin při 20 až 40 °C a po odstranění jejího nezreagovaného podílu se stanoví koncentrace enzymu, která je přímo úměrná koncentraci alfa-laktalbuminu .

Výhodou uvedeného způsobu podle vynálezu je především odstranění rizika ozáření a kontaminace radionuklidy. Metodu lze provádět v běžně vybavených biochemických laboratořích. Nekompetitivní způsob stanovení eliminuje nutnost složitých kroků k odstranění interference látek ze vzorku,

Citlivost a reprodukovatelnost metody je srovnatelná s metodou radioimunostanovení. Přesnost v sérii a v čase odpovídá požadavkům klinické použitelnosti metody, to je v sérii 8 %, v čase 15 až 20 %. Správnost byla testována na širokém souboru pozitivních a negativních kontrolních sér, stanovením vnitřního přídavku a ředěním vzorků o vyšší koncentraci alfa-laktalbuminu. Způsob je jednoduchý, analýza se provádí v jedné zkumavce nebo jamce mikrotitrační destičky bez složitých operací a to v průběhu jednoho dne v sériích 50 i více vzorků.

Dále jsou uvedeny příklady možného způsobu stanovení lidského alfa-laktalbuminu ve vzorku.

Příklad 1

Příprava alfa-laktalbuminu: 1,5 g syrovátkových bílkovin, což je podíl lidského mléka získaný po precipitaci kaseinů při pH 4,6 za teploty 25 °C, je frakcionován na sloupci Sephadexu G-150 (5 x 80 cm) v pufru 0,02 mol/1 tris-(hydroxymetyl)-aminometan s kyselinou chlorovodíkovou, pH 7,4 s 0,1 mol/1 chloridem draselným. Polyakrylamidovou elektroforézou s dodecylsulfátem sodným (koncentrace akrylamidu 100 g/1) jsou identifikovány frakce bohaté na alfa-laktalbumin (molekulová hmotnost přibližně 14 000), ty jsou dále rechromatografovány na DEAE -Sephadexu A-50: 200 mg bílkoviny se eluuje ze sloupce 2,5 x 40 cm lineárním gradien-. tem chloridu sodného (0,13 až 0,39 mol/1) v 0,02 mol/1 fosfátovém pufru o pH 7,4.

Dominantní frakce vytékající při koncentraci 0,3 mol/1 chloridu sodného je dialyzována, ,lyofilizována a užita pro přípravu protilátky.

Příprava protilátky proti alfa-laktalbuminu: provádí se imunizací kozy podle metody chráněné autorským osvědčením č. 209 966. Podstata metody spočívá v tom, že alfa-laktalbumin se emulguje dvousložkovým adjuvans, které obsahuje suspenzí hydroxidu hlinitého ve vodě a parafinový olej a vzniklá emulze se aplikuje narkotizovaným kozám intradermálně a opakovaně ve třítýdenních intervalech vždy na více, například 50 míst.

Deset až dvacet dnů po poslední imunizaci se odebere krev imunizovaného zvířete a ze séra je izolována specifická protilátka afinitní chromatografii na alfa-laktalbumin-Sepharose. Alfa-laktalbumin-Sepharosa je připravena navázáním izolovaného alfa-laktalbuminu (90 mg) na CNBr-aktivovanou Sepharosu (15 g) v pufru 0,15 mol/1 kyselý uhličitan sodný s 0,5 mol/1 chloridem sodným o pH 8,3. Po 2 hodinách při 25 °C teplotě je suspenze promyta pufrem užitým při reakci, neobsazená vazebná místa jsou blokována přídavkem 25 ml 1 mol/1 etanolaminu po dobu 16 hodin při 4 °C.

Na sloupec alfa-laktalbumin-Sepharosy o rozměrech 1,6 x 40 cm se nanese 10 ml séra odebraného z imunizované kozy, vysyceného normálním lidským séřem v poměru 9:1 (9 objemových dílů antiséra s jedním objemovým dílem normálního lidského séra). Eluce specifické protilátky ze sloupce se provádí 0,1 mol/1 glycinovým pufrem o pH 2,5. Po rychlé neutralizaci pevným tris-(hydroxymetyl)-aminometanem je bílkovina dialyzována proti vodě a lyofilizována.

Příprava pevné fáze s navázanou protilátkou: specifická protilátka je naředěna ve vazebném pufru uhličitan sodný - kyselý uhličitan sodný, 0,05 mol/1 o pH 9,5 na optimální koncentraci, to je 5 mg/1. Objem 0,2 ml tohoto roztoku je sorbován 1 hodinu při 37 °C a dále 16 hodin při 4 °C na polystyrénovou zkumavku o objemu 5 ml. Po odsátí roztoku je zkumavka promyta, a to 1 x 0,5 ml pufrovaného fyziologického roztoku o pH 7,2, 1 χ 1 ml pufrovaného fyziologického roztoku s 0,05 % objemovými polyoxyetylensorbitan monolaurátu a 1 χ 1 ml pufrovaného fyziologického roztoku. Do zkumavky se napipetuje 0,4 ml roztoku o koncentraci 0,5 % hmot. hovězího sérového albuminu v pufrovaném fyziologickém roztoku a po 40 minutách při 25 °C se roztok odsaje.

Vazba alfa-laktalbuminu ze vzorku: objem 0,2 ml vzorku (např. séra) ředěného roztokem o 0,5 % hmot. hovězího sérumalbuminu v pufrovaném fyziologickém roztoku je inkubován ve zkumavce s navázanou protilátkou po dobu 2 hodin při 37 °C. Po odsátí roztoku je opakováno promytí zkumavky a to 1 x 0,5 ml pufrovaného fyziologického roztoku, 2 χ 1 ml pufrovaného fyziologického roztoku s 0,05 % objemovými polyoxyetylensorbitan monolaurátu a 1 x 5 ml pufrovaného fyziologického roztoku.

Vazba protilátky s navázaným enzymem: specifická protilátka s kovalentně navázanou peroxidázou se připraví reakcí 0,2 ml 1,25 % objemových glutaraldehydu s 10 mg peroxidázy o vhodné čistotě (RZ =3), po 16 hodinách při teplotě 25 °C se volný glutaraldehyd oddialýzuje a přidá se 5 mg afinitně purifikované protilátky. Reakce probíhá 16 hodin pří 4 °C. Po inkubaci s. 0,1 ml 0,2 mol/1 lysinu se roztok skladuje se shodným objemem glycerinu při -20 °C. Tento konjugát se naředí optimálně (to je na 2 až 4 mg bílkoviny/1, koncentrace kolísá podle šarže konjugátu) v roztoku 1 % hmot. sérového hovězího albuminu v pufrovaném fyziologickém roztoku; 0,2 ml tohoto roztoku reaguje s imunokomplexem sorbovaným na zkumavce po dobu 2 hodin při 37 °C.

Po odsátí a promytí zkumavky (1 x 0,5 ml pufrovaného fyziologického roztoku, 3 χ 1 ml pufrovaného fyziologického roztoku s 0,05 % objemovými polyoxyetylensorbitan monolaurátu a 1 x 5 ml pufrovaného fyziologického roztoku), je navázaná peroxidáza stanovena přídavkem 0,3 ml roztoku substrátu, to je peroxidu vodíku o koncentraci 1 ml 30% roztoku/1 s o-fenylen:diaminem (0,22 mol/1) v 0,15 mol/1 fosfát-citrátovém pufru o pH 5,0. Po 20 minutách je reakce zastavena přídavkem 2,5 ml kyseliny sírové (5,5 mol/1) a absorbanoe roztoku měřena při 492 nm. Koncentrace alfa-laktalbuminu v neznámých vzorcích je určena z kalibrační křivky za užití řady standardů alfa-laktalbuminu v rozsahu 0,1 až 4 ng ve vzorku, jejímiž body je (proložena hyperbola druhého stupně.

Příklad 2

Specifická protilátka připravená postupem shodným jako v příkladu 1 je navázána na jamky mikrotitračních polystyrénových destiček za užití 0,1 ml roztoku o koncentraci 2,5 mg bílkoviny/1. Promytí i vysycení jamek hovězím sérumalbuminem se provádí naplněním jamek vždy až po okraj. Ve všech dalších reakčnich krocích podle příkladu 1 se používá poloviční objem činidel.

Claims (1)

1. Způsob kvantitativního stanovení alfa-laktalbuminu v tělních tekutinách a vodných roztocích, vyznačený tím, že tělní tekutina nebo vodný roztok obsahující alfa-laktalbumin se uvede do kontaktu s protilátkou proti alfa-laktalbuminu sorbovanou z roztoku o koncentraci 0,1 až 20 mg/1 při teplotě 4 až 40 °C po dobu 1 až 72 hodin na pevný nosič, například na stěny jamek polystyrénové destičky, zbavený 3 až 5 násobným vymýváním například pufrovaným fyziologickým roztokem s neiontovým detergentem nenasorbované protilátky proti alfa-laktalbuminu a nechá se reagovat za teploty 20 až 40 °C po dobu 1 až 5 hodin za vzniku imunokoplexu, načež po opětném 3 až 5 násobném vymývání například pufrovaným fyziologickým roztokem s s neiontovým detergentem pevného nosiče se sorbovaný imunokoplex nechá reagovat s vodným roztokem protilátky proti alfa-laktalbuminu značené enzymem o koncentraci bílkoviny 0,1 až 20 mg/1, a to po dobu 1 až 5 hodin při 20 až 40 °C a po odstranění jejího nezreagovaného podílu se stanoví koncentrace enzymu, která je přímo úměrná koncentraci alfa-laktalbuminu.