CS258362B1 - Method of alpha-lactalbumin's quantitative determination in body cavities and aqueous solutions - Google Patents
Method of alpha-lactalbumin's quantitative determination in body cavities and aqueous solutions Download PDFInfo
- Publication number
- CS258362B1 CS258362B1 CS858102A CS810285A CS258362B1 CS 258362 B1 CS258362 B1 CS 258362B1 CS 858102 A CS858102 A CS 858102A CS 810285 A CS810285 A CS 810285A CS 258362 B1 CS258362 B1 CS 258362B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- lactalbumin
- alpha
- concentration
- antibody
- solution
- Prior art date
Links
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 title claims abstract description 25
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 235000021241 α-lactalbumin Nutrition 0.000 title claims abstract description 25
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 17
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims description 14
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002030 1,2-phenylene group Chemical group [H]C1=C([H])C([*:1])=C([*:2])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000946384 Homo sapiens Alpha-lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- HDFXRQJQZBPDLF-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].OC([O-])=O.OC([O-])=O HDFXRQJQZBPDLF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940083575 sodium dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Očelem řešeni je kvantitativní stanovení alfa-laktalbuminu v tělních tekutinách nebo vodných roztocích v koncentračním rozsahu 0 až 200 ,ug/l. Dosahuje se ho tím, že alfa-laktalbumin obsažený v tělní tekutině nebo ve vodné roztoku se uvede do kontaktu s protilátkou proti alfa-laktalbuminu, sorbovanou na pevný nosič, z něhož byl nadbytek nenasorbované protilátky odstraněn vymýváním. Na vytvořený imunokomplex je po opakovaném promytí pevného nosiče navázána protilátka proti alfa-laktalbuminu značená enzymem. Po odstraněni jejího nezreagovaného podílu se stanoví koncentrace enzymu, která je přímo úměrná koncentraci alfa-laktalbuminu. Řešení je využíváné v oboru klinické biochemie pro stanovení koncentrace alfa-laktalbuminu v séru nebo jiných tělních tekutinách, především u onkologických nemocných.The aim of the solution is quantitative determination alpha-lactalbumin in body fluids or aqueous solutions in the concentration range 0 to 200 µg / L. It is achieved by that alpha-lactalbumin contained in body fluid or in contact with the aqueous solution with anti-alpha-lactalbumin antibody, sorbed onto a solid support from which excess was unsaturated antibody was removed by washing. The immunocomplex formed is repeated washing the solid support with the antibody enzyme-labeled alpha-lactalbumin. After to remove its unreacted portion determine the concentration of enzyme that is directly proportional to the alpha-lactalbumin concentration. Solution is used in clinical biochemistry for determining alpha-lactalbumin concentration in serum or other body fluids, especially in oncological patients.
Description
Vynález se týká způsobu kvantitativního stanovení alfa-laktalbuminu v tělních tekutinách a ve vodných roztocích.The invention relates to a method for the quantitative determination of alpha-lactalbumin in body fluids and aqueous solutions.
Účelem vynálezu je stanovit alfa-laktalbumin v koncetracích, které se vyskytují v lidském séru, eventuálně v jiných tělních tekutinách (mléko, cystická tekutina prsu) nebo extraktech tkání. Stanovení této bílkoviny specificky syntetizované v mléčné žláze se uplatňuje především při studiu procesu vývoje rakoviny mléčné žlázy.The purpose of the invention is to determine alpha-lactalbumin in concentrations that occur in human serum, possibly in other body fluids (milk, breast cystic fluid) or tissue extracts. The determination of this protein specifically synthesized in the mammary gland is particularly useful in the study of the development of mammary cancer.
Je známý způsob kvantitativního stanovení alfa-laktalbuminu v tělních tekutinách metodou radioimunostanovení (K. L. Woods, D. H. Cove, J. M. Morrison, D. A. Heath: Eur. J. Cancer 15 (1979) 47-51). Nevýhodou tohoto způsobu je kompetitivní princip stanovení, kdy interferující složky ze vzorku (séra) je třeba předem odstranit vysrážením. Další nevýhodou je omezení této metody pouze na laboratoře se speciálním a nákladným přístrojovým vybavením, neméně závažné je i možné riziko kontaminace radionuklidy.A method for the quantitative determination of alpha-lactalbumin in body fluids by the radioimmunoassay method is known (K.L. Woods, D.H. Cove, JM Morrison, D.A. Heath: Eur. J. Cancer 15 (1979) 47-51). The disadvantage of this method is the competitive principle of determining that interfering components from the sample (serum) must be removed by precipitation beforehand. Another disadvantage is the limitation of this method only to laboratories with special and expensive instrumentation, as well as the potential risk of contamination by radionuclides.
Výše uvedené nedostatky řeší metoda kvantitativního stanovení alfa-laktalbuminu v tělních tekutinách a vodných roztocích podle vynálezu, jejíž podstata spočívá v tom, že tělní tekutiny nebo vodný roztok obsahující alfa-laktalbumin se uvede do kontaktu s protilátkou proti alfa-laktalbuminu sorbovanou z roztoku o koncentraci 0,1 až 20 mg/1 při teplotě 4 až 40 °C po dobu 1 až 72 hodin na pevný nosič, s výhodou na stěny jamek polystyrénové destičky, zbavené opakovaným vymýváním nenasorbované protilátky proti alfa-laktalbuminu a nechá se reagovat za teploty 20 až 40 °C po dobu 1 až 5 hodin za vzniku imunokomplexu, načež po opětném opakováném promývání pevného nosiče se sorbovaný imunokomplex nechá reagovat s vodným roztokem protilátky proti alfa-laktalbuminu značené enzymem, o koncentraci bílkoviny 0,1 až 20 mg/1, a to po dobu 1 až 5 hodin při 20 až 40 °C a po odstranění jejího nezreagovaného podílu se stanoví koncentrace enzymu, která je přímo úměrná koncentraci alfa-laktalbuminu .The aforementioned drawbacks are solved by the method for the quantitative determination of alpha-lactalbumin in body fluids and aqueous solutions according to the invention, which comprises contacting a body fluid or an aqueous solution containing alpha-lactalbumin with an antibody against alpha-lactalbumin sorbed from a solution at a concentration 0.1 to 20 mg / l at 4 to 40 ° C for 1 to 72 hours on a solid support, preferably on the well walls of a polystyrene plate, free from repeated washings of unadsorbed anti-alpha-lactalbumin antibody and allowed to react at 20 to 40 ° C for 1 to 5 hours to form an immunocomplex, then after repeated washing of the solid support, the sorbed immunocomplex is reacted with an aqueous solution of an enzyme labeled anti-alpha-lactalbumin, having a protein concentration of 0.1 to 20 mg / l, for 1 to 5 hours at 20 to 40 ° C and after removal of its unreacted fraction, the co enzyme concentration, which is proportional to the alpha-lactalbumin concentration.
Výhodou uvedeného způsobu podle vynálezu je především odstranění rizika ozáření a kontaminace radionuklidy. Metodu lze provádět v běžně vybavených biochemických laboratořích. Nekompetitivní způsob stanovení eliminuje nutnost složitých kroků k odstranění interference látek ze vzorku,The advantage of the method according to the invention is in particular the elimination of the risk of radiation and contamination by radionuclides. The method can be performed in commonly equipped biochemical laboratories. The noncompetitive assay eliminates the need for complex steps to eliminate interference from the sample,
Citlivost a reprodukovatelnost metody je srovnatelná s metodou radioimunostanovení. Přesnost v sérii a v čase odpovídá požadavkům klinické použitelnosti metody, to je v sérii 8 %, v čase 15 až 20 %. Správnost byla testována na širokém souboru pozitivních a negativních kontrolních sér, stanovením vnitřního přídavku a ředěním vzorků o vyšší koncentraci alfa-laktalbuminu. Způsob je jednoduchý, analýza se provádí v jedné zkumavce nebo jamce mikrotitrační destičky bez složitých operací a to v průběhu jednoho dne v sériích 50 i více vzorků.The sensitivity and reproducibility of the method is comparable to the radioimmunoassay method. The accuracy in the series and over time corresponds to the clinical applicability requirements of the method, i.e. in the series of 8%, at the time of 15-20%. Accuracy was tested on a wide set of positive and negative control sera, by the determination of the internal addition and by dilution of samples with higher alpha-lactalbumin concentration. The method is simple, the analysis is performed in a single tube or well of a microtiter plate without complicated operations, in one day in a series of 50 or more samples.
Dále jsou uvedeny příklady možného způsobu stanovení lidského alfa-laktalbuminu ve vzorku.The following are examples of a possible method for determining human alpha-lactalbumin in a sample.
Příklad 1Example 1
Příprava alfa-laktalbuminu: 1,5 g syrovátkových bílkovin, což je podíl lidského mléka získaný po precipitaci kaseinů při pH 4,6 za teploty 25 °C, je frakcionován na sloupci Sephadexu G-150 (5 x 80 cm) v pufru 0,02 mol/1 tris-(hydroxymetyl)-aminometan s kyselinou chlorovodíkovou, pH 7,4 s 0,1 mol/1 chloridem draselným. Polyakrylamidovou elektroforézou s dodecylsulfátem sodným (koncentrace akrylamidu 100 g/1) jsou identifikovány frakce bohaté na alfa-laktalbumin (molekulová hmotnost přibližně 14 000), ty jsou dále rechromatografovány na DEAE -Sephadexu A-50: 200 mg bílkoviny se eluuje ze sloupce 2,5 x 40 cm lineárním gradien-. tem chloridu sodného (0,13 až 0,39 mol/1) v 0,02 mol/1 fosfátovém pufru o pH 7,4.Preparation of alpha-lactalbumin: 1.5 g whey protein, the proportion of human milk obtained after casein precipitation at pH 4.6 at 25 ° C, is fractionated on a Sephadex G-150 column (5 x 80 cm) in buffer 0, 02 mol / l tris- (hydroxymethyl) -aminomethane with hydrochloric acid, pH 7.4 with 0.1 mol / l potassium chloride. Sodium dodecylsulfate polyacrylamide electrophoresis (100 g / l acrylamide concentration) identifies alpha-lactalbumin-rich fractions (molecular weight approximately 14,000), which are further rechromatographed on DEAE-Sephadex A-50: 200 mg of protein elutes from column 2, 5 x 40 cm linear gradien-. of sodium chloride (0.13 to 0.39 mol / l) in 0.02 mol / l phosphate buffer pH 7.4.
Dominantní frakce vytékající při koncentraci 0,3 mol/1 chloridu sodného je dialyzována, ,lyofilizována a užita pro přípravu protilátky.The dominant fraction eluting at a concentration of 0.3 mol / l sodium chloride is dialyzed, lyophilized and used to prepare the antibody.
Příprava protilátky proti alfa-laktalbuminu: provádí se imunizací kozy podle metody chráněné autorským osvědčením č. 209 966. Podstata metody spočívá v tom, že alfa-laktalbumin se emulguje dvousložkovým adjuvans, které obsahuje suspenzí hydroxidu hlinitého ve vodě a parafinový olej a vzniklá emulze se aplikuje narkotizovaným kozám intradermálně a opakovaně ve třítýdenních intervalech vždy na více, například 50 míst.Preparation of an anti-alpha-lactalbumin antibody: carried out by immunizing a goat according to the method protected by the author's certificate No. 209 966. The essence of the method is that the alpha-lactalbumin is emulsified with a two-component adjuvant containing aluminum hydroxide / water suspension and paraffin oil. apply intradermally and repeatedly at three-week intervals to narcotized goats at more, for example, 50 sites.
Deset až dvacet dnů po poslední imunizaci se odebere krev imunizovaného zvířete a ze séra je izolována specifická protilátka afinitní chromatografii na alfa-laktalbumin-Sepharose. Alfa-laktalbumin-Sepharosa je připravena navázáním izolovaného alfa-laktalbuminu (90 mg) na CNBr-aktivovanou Sepharosu (15 g) v pufru 0,15 mol/1 kyselý uhličitan sodný s 0,5 mol/1 chloridem sodným o pH 8,3. Po 2 hodinách při 25 °C teplotě je suspenze promyta pufrem užitým při reakci, neobsazená vazebná místa jsou blokována přídavkem 25 ml 1 mol/1 etanolaminu po dobu 16 hodin při 4 °C.Ten to twenty days after the last immunization, the immunized animal is bled and specific antibody is isolated from the serum by affinity chromatography on alpha-lactalbumin-Sepharose. Alpha-lactalbumin-Sepharose is prepared by binding isolated alpha-lactalbumin (90 mg) to CNBr-activated Sepharose (15 g) in 0.15 mol / l sodium bicarbonate buffer with 0.5 mol / l sodium chloride pH 8.3 . After 2 hours at 25 ° C the suspension is washed with the buffer used in the reaction, unoccupied binding sites are blocked by addition of 25 ml of 1 mol / L ethanolamine for 16 hours at 4 ° C.
Na sloupec alfa-laktalbumin-Sepharosy o rozměrech 1,6 x 40 cm se nanese 10 ml séra odebraného z imunizované kozy, vysyceného normálním lidským séřem v poměru 9:1 (9 objemových dílů antiséra s jedním objemovým dílem normálního lidského séra). Eluce specifické protilátky ze sloupce se provádí 0,1 mol/1 glycinovým pufrem o pH 2,5. Po rychlé neutralizaci pevným tris-(hydroxymetyl)-aminometanem je bílkovina dialyzována proti vodě a lyofilizována.10 ml of serum collected from an immunized goat, saturated with normal human serum at a ratio of 9: 1 (9 volumes of antisera with one volume of normal human serum) was applied to a 1.6 x 40 cm alpha-lactalbumin-Sepharose column. The elution of the specific antibody from the column is performed with 0.1 M glycine buffer pH 2.5. After rapid neutralization with solid tris- (hydroxymethyl) -aminomethane, the protein is dialyzed against water and lyophilized.
Příprava pevné fáze s navázanou protilátkou: specifická protilátka je naředěna ve vazebném pufru uhličitan sodný - kyselý uhličitan sodný, 0,05 mol/1 o pH 9,5 na optimální koncentraci, to je 5 mg/1. Objem 0,2 ml tohoto roztoku je sorbován 1 hodinu při 37 °C a dále 16 hodin při 4 °C na polystyrénovou zkumavku o objemu 5 ml. Po odsátí roztoku je zkumavka promyta, a to 1 x 0,5 ml pufrovaného fyziologického roztoku o pH 7,2, 1 χ 1 ml pufrovaného fyziologického roztoku s 0,05 % objemovými polyoxyetylensorbitan monolaurátu a 1 χ 1 ml pufrovaného fyziologického roztoku. Do zkumavky se napipetuje 0,4 ml roztoku o koncentraci 0,5 % hmot. hovězího sérového albuminu v pufrovaném fyziologickém roztoku a po 40 minutách při 25 °C se roztok odsaje.Preparation of antibody-bound solid phase: The specific antibody is diluted in 0.05M sodium carbonate-sodium bicarbonate binding buffer at pH 9.5 to an optimal concentration of 5 mg / L. The volume of 0.2 ml of this solution is sorbed for 1 hour at 37 ° C and 16 hours at 4 ° C to a 5 ml polystyrene tube. After aspirating the solution, the tube is washed with 1 x 0.5 ml of buffered saline pH 7.2, 1 1 1 ml of buffered saline with 0.05% by volume polyoxyethylene sorbitan monolaurate and 1 χ 1 ml of buffered saline. 0.4 ml of a 0.5% by weight solution is pipetted into the tube. bovine serum albumin in buffered saline and after 40 minutes at 25 ° C the solution is aspirated.
Vazba alfa-laktalbuminu ze vzorku: objem 0,2 ml vzorku (např. séra) ředěného roztokem o 0,5 % hmot. hovězího sérumalbuminu v pufrovaném fyziologickém roztoku je inkubován ve zkumavce s navázanou protilátkou po dobu 2 hodin při 37 °C. Po odsátí roztoku je opakováno promytí zkumavky a to 1 x 0,5 ml pufrovaného fyziologického roztoku, 2 χ 1 ml pufrovaného fyziologického roztoku s 0,05 % objemovými polyoxyetylensorbitan monolaurátu a 1 x 5 ml pufrovaného fyziologického roztoku.Binding of alpha-lactalbumin from the sample: 0.2 ml sample volume (eg serum) diluted with 0.5% w / w solution. bovine serum albumin in buffered saline is incubated in an antibody-bound tube for 2 hours at 37 ° C. After aspirating the solution, the tube is washed again with 1 x 0.5 ml of buffered saline, 2 χ 1 ml of buffered saline with 0.05% by volume polyoxyethylene sorbitan monolaurate and 1 x 5 ml of buffered saline.
Vazba protilátky s navázaným enzymem: specifická protilátka s kovalentně navázanou peroxidázou se připraví reakcí 0,2 ml 1,25 % objemových glutaraldehydu s 10 mg peroxidázy o vhodné čistotě (RZ =3), po 16 hodinách při teplotě 25 °C se volný glutaraldehyd oddialýzuje a přidá se 5 mg afinitně purifikované protilátky. Reakce probíhá 16 hodin pří 4 °C. Po inkubaci s. 0,1 ml 0,2 mol/1 lysinu se roztok skladuje se shodným objemem glycerinu při -20 °C. Tento konjugát se naředí optimálně (to je na 2 až 4 mg bílkoviny/1, koncentrace kolísá podle šarže konjugátu) v roztoku 1 % hmot. sérového hovězího albuminu v pufrovaném fyziologickém roztoku; 0,2 ml tohoto roztoku reaguje s imunokomplexem sorbovaným na zkumavce po dobu 2 hodin při 37 °C.Enzyme-bound antibody binding: specific antibody with covalently bound peroxidase is prepared by reacting 0.2 ml of 1.25% by volume glutaraldehyde with 10 mg of peroxidase of suitable purity (RZ = 3), after 16 hours at 25 ° C the free glutaraldehyde is distilled off and 5 mg of affinity purified antibody is added. The reaction was run at 4 ° C for 16 hours. After incubation with 0.1 ml of 0.2 mol / l lysine, the solution is stored with an equal volume of glycerin at -20 ° C. This conjugate is diluted optimally (i.e. to 2 to 4 mg protein / l, the concentration varies according to the batch of conjugate) in a 1 wt% solution. serum bovine albumin in buffered saline; 0.2 ml of this solution reacts with the immunocomplex sorbed on the tube for 2 hours at 37 ° C.
Po odsátí a promytí zkumavky (1 x 0,5 ml pufrovaného fyziologického roztoku, 3 χ 1 ml pufrovaného fyziologického roztoku s 0,05 % objemovými polyoxyetylensorbitan monolaurátu a 1 x 5 ml pufrovaného fyziologického roztoku), je navázaná peroxidáza stanovena přídavkem 0,3 ml roztoku substrátu, to je peroxidu vodíku o koncentraci 1 ml 30% roztoku/1 s o-fenylen:diaminem (0,22 mol/1) v 0,15 mol/1 fosfát-citrátovém pufru o pH 5,0. Po 20 minutách je reakce zastavena přídavkem 2,5 ml kyseliny sírové (5,5 mol/1) a absorbanoe roztoku měřena při 492 nm. Koncentrace alfa-laktalbuminu v neznámých vzorcích je určena z kalibrační křivky za užití řady standardů alfa-laktalbuminu v rozsahu 0,1 až 4 ng ve vzorku, jejímiž body je (proložena hyperbola druhého stupně.After aspirating and washing the tube (1 x 0.5 ml buffered saline, 3 χ 1 ml buffered saline with 0.05% by volume polyoxyethylene sorbitan monolaurate and 1 x 5 ml buffered saline), bound peroxidase is determined by adding 0.3 ml of a substrate solution, i.e. hydrogen peroxide at a concentration of 1 ml of a 30% solution / l with o-phenylene: diamine (0.22 mol / l) in 0.15 mol / l phosphate-citrate buffer, pH 5.0. After 20 minutes, the reaction is stopped by the addition of 2.5 ml of sulfuric acid (5.5 mol / l) and the absorbance of the solution measured at 492 nm. The concentration of alpha-lactalbumin in unknown samples is determined from a calibration curve using a number of alpha-lactalbumin standards ranging from 0.1 to 4 ng in the sample whose points are (interleaved second stage hyperbola).
Příklad 2Example 2
Specifická protilátka připravená postupem shodným jako v příkladu 1 je navázána na jamky mikrotitračních polystyrénových destiček za užití 0,1 ml roztoku o koncentraci 2,5 mg bílkoviny/1. Promytí i vysycení jamek hovězím sérumalbuminem se provádí naplněním jamek vždy až po okraj. Ve všech dalších reakčnich krocích podle příkladu 1 se používá poloviční objem činidel.The specific antibody prepared as in Example 1 is bound to the wells of microtitre polystyrene plates using 0.1 ml of a 2.5 mg protein / l solution. Washing and saturation of the wells with bovine serum albumin is performed by filling the wells to the brim. In all other reaction steps of Example 1, half the volume of reagents is used.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS858102A CS258362B1 (en) | 1985-11-11 | 1985-11-11 | Method of alpha-lactalbumin's quantitative determination in body cavities and aqueous solutions |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS858102A CS258362B1 (en) | 1985-11-11 | 1985-11-11 | Method of alpha-lactalbumin's quantitative determination in body cavities and aqueous solutions |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS810285A1 CS810285A1 (en) | 1987-12-17 |
| CS258362B1 true CS258362B1 (en) | 1988-08-16 |
Family
ID=5431169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS858102A CS258362B1 (en) | 1985-11-11 | 1985-11-11 | Method of alpha-lactalbumin's quantitative determination in body cavities and aqueous solutions |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS258362B1 (en) |
-
1985
- 1985-11-11 CS CS858102A patent/CS258362B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS810285A1 (en) | 1987-12-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tatarinov et al. | Development of a radioimmunoassay for pregnancy‐specific beta1‐globulin and its measurement in serum of patients with trophoblastic and non‐trophoblastic tumours | |
| US4353982A (en) | Immunochemical assay for creatine kinase-MB isoenzyme | |
| CA1160566A (en) | Immunological determination method | |
| EP0064274B1 (en) | Method for assaying antigen-antibody reactions and reagent therefor | |
| JPS6367661B2 (en) | ||
| JPS58203919A (en) | Manufacture of immunogloblin half molecule and crossbred antibody | |
| US4804625A (en) | Assay procedures | |
| JP2636331B2 (en) | One-step assay for antigen-specific antibodies and suitable reagents | |
| CA1256025A (en) | Immuno-chemical measurement process for haptens and proteins | |
| Pangburn | A fluorimetric assay for native C3: the hemolytically active form of the third component of human complement | |
| Sato et al. | Scurvy-prone animals, including man, monkey, and guinea pig, do not express the gene for gulonolactone oxidase | |
| Thomas et al. | Fluorometric ELISA for the detection and quantitation of metallothionein | |
| EP0535162B1 (en) | Analyte variant analysis | |
| US4722890A (en) | Quantitative assay for human terminal complement cascade activation | |
| CS237318B2 (en) | Method of evaluating of enzymes and agent to perform the method | |
| US4729961A (en) | Process for the detection and assay by erythroadsorption | |
| Nibbering et al. | Microphotometric quantitation of the reaction product of several indirect immunoperoxidase methods demonstrating monoclonal antibody binding to antigens immobilized on nitrocellulose. | |
| LaRochelle et al. | Immunochemical detection of proteins biotinylated on nitrocellulose replicas | |
| JPH05295000A (en) | Covalent hybrid antibody, preparation of the same and homogeneous immunoassay using the same | |
| WO1993001304A1 (en) | Synthetic peptides related to fiv-env proteins | |
| RU2065164C1 (en) | Diagnostic test-system for hepatitis virus a detection | |
| Tsugawa et al. | An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for guanosine 3′, 5′-cyclic monophosphate (cGMP) in human plasma and urine using monoclonal antibody | |
| CS258362B1 (en) | Method of alpha-lactalbumin's quantitative determination in body cavities and aqueous solutions | |
| EP0106615B1 (en) | Assay for the free portion of substances in biological fluids | |
| Stevens et al. | Antibodies to lactalbumin interfere with its radioimmunoassay in human plasma |