CS258054B1 - Způsob biologického sledováni dráždivosti a toxicity vláken nebo plošných tvarů - Google Patents

Abstract

Způsob biologického sledování dráždivosti a toxicity vláken nebo ^lošnýoh tvarů spočívá v tom, že zkoušeny materiál ve formě vláken nebo plošných tvarů se uv$de do kontaktu s živými živočišnými buňkami v kultivačním médiu a biologická odezva .živočišných buněk na vložený zkoušený materiál se sleduje mikroskopicky, popřípadě mikrofotografioky nebo mikrokinematografioky.

Description

Vynález se týká způsobu biologického sledování dráždivosti a toxicity vláken nebo plošných tvarů.

V současné dobé je zjišťována biologická dráždivost chirurgických materiálů výhradně všíváním nebo implantací těchto materiálů do tkání pokusných zvířat a histologiekým vyhodnocováním okolní tkáně. Tyto zkoušky trvají několik měsíců, jsou pracné a nákladné. Při ověřování všitých mikrochirurgických vláken se často stává, že v důsledku jejich migrace a nepatrných rozměrů se nepodaří zhotovit preparát z okolí vlákna. Naproti tomu například u monofilních vláken vyšších průměrů dochází často k projevu dráždění tkáně v důsledku působení většího cizího tělesa.

Výše uvedené nedostatky jsou podstatně odstraněny způsobem biologického sledování dráždivosti a toxicity vláken nebo plošných tvarů podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se zkoušený materiál ve formě vláken nebo proužků uvede do kontaktu s živými živočišnými buňkami v kultivačním mediu a biologická odezva buněk na vložený zkoušený materiál se sleduje mikroskopicky, mikrofotografický nebo mikrokinematograficky. Zkoušený materiál lze na podložku na níž je narostlé vrstva živočišných buněk fixovat pomocí proužku filtrační membrány. Narostlá vrstva živočišných buněk s přiloženým zkoušeným materiálem se přelije kultivačním mediem. Zkoušený materiál lze též na čistou podložku fixovat pomocí bílkovinného lepidla a přelít suspenzí živočišných buněk v kultivačním médiu.

Hlavní výhody biologického sledování dráždivosti a toxicity vláken nebo plošných útvarů podle vynálezu spočívají ve zkrá258054 cení doby zkoušek z několika měsíců na několik hodin. Dále jsou podstatně nižší náklady na tyto zkoušky. V případě zkoušek in vivo vyžaduje každé časové sledování utracení několika laboratorních zvířat. U zkoušek in vitro lze snímat stav biologické odezvy buněk v kteroukoliv dobu jejich kultivace, a to zachycením změn v jejich množení, nárůstu v čase, případně morfologiekých změn bez zvýšení nákladů na zkoušení. V případě toxicity se vytvoří pathologické změny na buňkách narostlých na skle nebo v případě použití buněčné suspenze nedojde k rozprostření nebo adhesi buněk v blízkosti zkoušeného materiálu. Zóna poškozených nebo nerozprostřených a neadhezovaných buněk je tím větší, čím je zkoušený materiál toxičtější. Dokonalé upevnění zkoušených vláken nebo proužků umožňuje mikrofotografické snímky téhož místa a Vzájemné srovnání snímků z různých časových, údobí. Jako kontrolní jsou záběry buněk ničím neovlivněné kultury, bez zkoušených vláken nebo proužků, přechovávané po stejnou dobu v týchž podmínkách. Způsob dle vynálezu je citlivější než zkoušky in vivo a umožňuje sériové ověřování vzorků vláken. Pro velkou potřebu laboratorních zvířat a pracnost není u metod in vivo možná práce ve větších sériích. Metoda podle vynálezu umožňuje sledovat i biologickou odezvu živočišných buněk na vnitřní části zkoušeného materiálu,použije-li se řez monofilních vláken, cévní protézou nebo dutými vlákny.

Reprodukovatelnost výsledků získaných způsobem podle vynálezu je vyšší než u metod in vivo.

Úseky vláken nebo odstřižky nebo řezy plošných tvarů v délkách 2 až 5 mm se přilepí na očištěné sklo, nejlépe bílkovinným lepidlem. Na sklo se zkoušenými vzorky se nalije buněčná suspenze s přesným počtem buněk v obohaceném kultivačním mediu a za udržované stálé teploty se od prvého styku buněk s vlákny provádí v časových intervalech mikrofotografické snímkování stejného úseku vzorku a jeho okolí. Při druhé metodě se buněčná suspenze s přesným počtem buněk nalije na očištěná skla, kde se ponechá sedimentovat. Na porostlá skla se položí úseky vláken nebo odstřižky nebo řezy plošných tvarů v délkách· 2 až 5 mm a přitlačí se proužky sterilní filtrační membrány. Potom se při258054

- 5 dá obohacené kultivační medium, udržuje se stálé kultivační teplota podle druhu použitých živočišných buněk. Mikrofotografické snímkování se provádí rovněž v časových intervalech od prvého styku buněk se vzorkem. Provádí se rovněž kontrolní snímky původní buněčné kultury bez vzorků, za stejných podmínek Při konečném hodnocení se vzájemně srovnávají snímky z jednotlivých časových úseků i původní buněčné kultury.

Výše uvedené příklady a popisy pouze vynález objasňují, ale neomeszyjí.

Mimo zjišťování dráždivost! a toxicity chirurgických šicích materiálů a zdravotnických materiálů určených k implantaci lze způsob dle vynálezu využít i k ověřování zdravotní nezávadnosti, například textilních materiálů a folií, které přijdou do přímého styku s Živou tkání. Této metody lze použít i pro případ, kdy dojde ke styku živé tkáně pouze s výluhem zkoušeného materiálu.

Způsob podle vynálezu je ilustrován následujícími příklady

Přikladl

Úsek mikrochirurgického Silonu dekadického značení OA podle PNY 830668 v délce 5 mm byl za sterilních kaut,el přiložen k L buňkám ustálené linie HEp 2, narostlým na mikroskopickém krycím sklíčku. Vlákno bylo přitlačeno a fixováno proužkem sterilní filtrační membrány. Buňky byly pozorovány v polosyntetickém mediu MEM, obohaceném 10 % bovinního séra, antibiotiky, bikarbonátovým ústojným roztokem a fenolovou červení, sloužící jako indikátor pH, za teploty 37 °C· živé buňky byly sledovány fázově koru/trastní optikou od okamžiku kontaktu se zkoušeným vláknem po dobu 12 hodin. V intervalech 30 minut byly snímány mikrofotografické záběry.

Příklad 2

Úseky chromovaného catgutu délky 3 mm byly přilepeny bílkovinným lepidlem do středu dna Petriho misky průměru 50 tam.

- 4 Byly přelity buněčnou suspenzí, která obsahovala v 1 ml

2,5 x 1O⁵ Živých buněk linie HEp 2. V ostatním byl postup obdob ný jako v příkladu 1.

Snímky u každého příkladu byly vzájemně srovnány i porovnány se snímky buněčné kultury, která nebyla ve styku se zkoušenými materiály. U příkladu 1 nevyvolalo zkoušené vlákno žádné změny buněk a jejich organel, ve shodě se zkušebními metodami na pokusných zvířatech dle PNY 83-04-68 a PNY 83-04-78 byl vzorek hodnocen jako tkáňově zcela tolerantní. U příkladu 2 rozprostřely se buňky ve vzdálenosti asi 1 mm od úseku vlákna, rovněž, ve shodě s výše uvedenými oficiálními zkušebními metodami byl vzorek hodnocen jako kontaktně až lokálně mírně toxický.

Claims (3)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob biologického sledování dráždivosti a toxicity vláken nebo plošných tvarů, vyznačující se tím, že zkoušený materiál ve formě vláken nebo plošných tvarů se uvede do kontaktu s živými živočišnými buňkami v kultivačním médiu a biologická odezva živočišných buněk na vložený zkoušený materiál se sleduje mikroskopicky, případně mikrofotograficky nebo mikrokinematograficky.
2. 2. Způsob podle bodu l^vyznačující se tím, že na vrstvu živočišných buněk narostlých na podložce se pomocí proužku filtrační membrány fixuje zkoušený materiál a přelije se kultivačním médiem. .
3. 3. Způsob podle bodu 1,vyznačující se tím, že zkoušený materiál se fixuje na čistou podložku pomoci bílkovinného lepidla a přelije se suspenzí živých živočišných buněk v kultivačním médiu.