CS252537B1 - Inaktivovaná vakcína proti neonatálnej koli hnačke teliat - Google Patents

Description

232337

Vynález sa týká sposobu výroby inaktivo-vanej vakcíny proti neonatálnej koli hnač-ke teliat, ktorá je technologicky připravo-vaná z kmeňov Escherichia coli K99+, u kto-rých počas submerzne] kultivácii je optima-lizovaná kvantitativná expresia adhezínutestovania na koňských a baraních erytro-cytoch, pomocOu manózorezistentnej hema-gutinácie, ktorú je možné použit pre špecifická prevenciu kolienteritíd teliat.

Kmene E. coli izolované z teliat s diag-nózou „neonatálna kolienteritída“ produkujúadhereněné antigény K99+, které reali-zují kolonizáciu tenkého čreva teliat. Expre-sia kolonizujúcich faktorov je proces regu-lovaný genetickým materiálom buňky. Mik-robiálně buňky počas rastu in vivo a in vit-ro vykazujú kvalitatívnu a kvantitatívnu fá-zová variáciu — ISAACSON a RICHTER:Escherichia coli 987P pilus: Purification andpartial characterization, J. Bacteriol. 146, s.874—889; JONES G. W., ISAACSON R. E.:Proteinaceus bacterial adhesine and theirreceptors. Brit. Rev. Microbio1. 10, 1983, s.229—260.

Pre technologická produkciu efektívnychimunogénov proti uvedenému ochoreniu jezvlášť doležitá kvantitativná fázová variá-cia produkčných kmeňov E. coli. Tento fe-nomén in vitro je regulovaný za podmienoksubmerznej kultivácie, ktoré sú odlišné odpodmienok pre kvalitatívnu fázová variáciu.Kvantitativná fázová variácia, ktorá pod-mieňuje maximálnu produkciu adhezínov,je primárnou podmienkou pre technologic-ká produkciu efektívnych imunogénov po-užitelných k špecifickej profylaxii hnačko-vých ochoreni teliat.

Doterajší stav poznatkov v oblasti bakte-riálnej genetiky a etiopatogenity E. coli ne-využíval fenomén kvantitatívnej fázovejvariácie v produkcii efektívnych látok použi-telných v imunoprofylaxii tohto ochorenia.Využitím tohto fenoménu v predmetnej ob-lasti zabezpečí synchronizáciu expresie ad-herenčného antigénu počas ce'ej submerz-nej produkčnej kultivácie E. coli K99+. Všeobecným trendom pro produkciu K99 !E. coli vakcín je kultivácia produkčnýchkmeňov v produkčnom médiu, ktorého zá-kladnou zložkou je Casamino acids (DIFCO).

Casamino acids 1,0 g Dihydrogénfosforečnan draselný 1,36 g Hydrogenfosforečnan sodný 10,10 g Glukóza 1,0 g Chlorid vápenatý dihydrát 0,0004 O Síran horečnatý heptahydrát 0,010 g Chlorid železitý tetrahydrát 0,000135 g Chlorid horečnatý 0,001 g Destilovaná voda do 1 000 ml

Autoři experimentálně ověřovali rožnedruhy produkčných živných médií, ktoré byzebezpečili maximálnu expresiu adherenč-ného antigénu. Z hladiska efektivnosti kvan- titatívnej expresie adherenčných antigénovbolo experimentálně dokázané, že autormivyvinuté nové produkčně médium zaisťujekvantitativné vyššiu produkciu adhezínu ajeho primárnou zložkou je kyslý kazeínovýhydrolyzát.

Autoři vynálezu izolovali a na základe fe-notypového prejavu stanovili adhereněnévlastnosti mnohých kmeňov E. coli, ktorépochádzali z teliat s akútnym výskytom ne-onatálnej kolienteritídy. Selekciou cielenýchvlastností izolovaných kmeňov a testovánímtýchto kmeňov v submerznej kultivácii bo ivybraté štyri kmene, uložené do čs. zbierkymikroo-rganizmov Univerzita JEP Brno, tl'.Obránců míru 10 pod číslami CCM 3908,CCM 3909, CCM 3910 a CCM 3911. Uvedenékmene za autormi definovaných kultivač-ných podmienok vyhovovali požadovanýmparamelrom, ktoré bolí stanovené pre tech-nologická produkciu efektívnej vakcíny.

Pre testovanie kvantitatívnej fázy rastukultury čo do produkcie adherečných an-tigénov bola použitá manózorezistentná he-maglutinácia. Pre charakteristiku kvalita-tívnej fázy rastu bola autormi použitásklíčková aglutinácia BRUSH BORDER testa rast na Simons-citrátovom agare s adoni-tom.

Pre zaistenie pozitivity v týchto reakciáchautoři vyvinuli nový druh produkčného mé-dia nasledujáceho zloženia:

Kyslý kazeinový hydrolyzát 3—15

Dihydrogenfosforečnan draselný 1,36

Hydrogenfosforečnan sodný 10,10

Glukóza 0,0—1,0

Chlorid vápenatý dihydrát 0,004 Síran horečnatý heptahydrát 0,10

Chlorid železitý sextahydrát 0,000135

Chlorid horečnatý tetrahydrát 0,001

Destilovaná voda do 1 000 ml g

Q o p- g g g g

Po ukončení laboratórnych ověřovacíchexperimentov bola připravená perorálna,chemicky inaktivovaná E. coli K99+ vakcí-na, ktorii autoři testovali v praktických cho-vatelských podmienkach. Vakcinácia bo avykonaná v mesiacoch februát, marec aapríl 1985. Celkove bolo vakcinovaných 294teliat. Ako kontrola slážila štatistika z me-siacov december 1984 a január 1985. Úhynteliat po započatí vakcinácie bol znížený o 19,5 %, počet diagnostikovanej hnačky kle-sol o 50,2 %, pričom nebola diagnostikova-ná koli hnačka a pokles mortality bol 71,8pere. Z uvedeného vyplývá, že vynález najdeširoké uplatnenie v chovoch hovadzieho do-bytka pri znižovaní výskytu neonatálnychkolieneritíd. Aplikácia tohto preparátu jejednoduchá, nakolko je možné vakcínu po-dávat v kolostre, připadne v mlieku.

Claims (3)

1. Příklad 1 Enteropatogénny kmeň Escherichia coliCCM 3908 sa kultivuje v 300 ml Erlenmay-erových bankách s obsahom 20 ml sterilně-ho média, kíorého zloženie je na str. 2 aktoré obsahuje 0,5 % kyslého kazeínovéhohydrolyzáíu a je bez glukózy. Následná in-kubácia prebleha 4 hod. pri 37 °C za inten-zívneho miešania. Po tejto inkubácii objem20 mi kultúry prenesieme do 4 000 ml Erlen-raayerovej banky s obsahom 300 ml steril-ného média a inkubujeme 3 hod. pri 37 °Cza intenzívneho miešania. Takto připrave-ná subkuitúru použijeme na inokuláciu fer-mentora v pomere 300 ml subkultúry na 7litrov sterilného média vyššie uvedeného.Submerzná kultivácia prebieba pri 37 °C zastálého miešania 600 ot/min. a aretácie ste·rilným vzducliom 8 1/min. Počas 8-hodino-vej kultivácie sú odoberané vzorky kultúrypre testáciu bakteriálnej sterility, pH hod-noty, denzity a detekcie adherečného anti-génu. Výsledná bakteriálna masa nesraieobsahovat žiadne kontaminuj ňce mikroor-ganizmy, s výslednou denzitou 1,0 meranouna Spekole oproti referenčnej vzorke 540nm s pozitívnou aglutinačnou rsakciou smonošpecifickým K99 + antisérom. Bakteriálně kulturu chemicky inaktivuje-me přidáním 5 % vodného roztoku formal-dehydu tak, aby výsledná koncentrácia bo-ta 0,050 až 0,090 g na 100 ml. Inaktivovanúkultúru egalizujeme tak, aby vo vakcínebol zastúpený každý kmeň v rovnakom ob-jeme. Výsledná koncentrácia inaktivova-ných mikroorganizmov v egalizovanej bak-teriálnej kultuře je 1—3 X 1010. Výsledná vakcína nesmie obsahovat cu-dziu bakteriální! a pliesňovú mikroflóru aje neškodná pre myš po perorálnej vakci- nácii 0,5 ml vakcíny. 20-násobné riedenievakcíny musí vykazovat pozitivnu agluti-načnú reakciu s monošpecifickým K99+ an-tisérom. Příklad 2 Enteropatogénny kmeň Escherichia co iCCM 3911 bol kultivovaný v 300 ml Erlen-mayerových bankách s obsahom 20 ml ste-rilného média, ktorého zloženie je na str.2 a ktoré obsahuje 1,5 % kyslého kazeíno-vého hydrolyzáíu a 0,1 % glukózy. Ďalšiatechnologická příprava a spracovanie bio-masy uvedeného kmeňa je analogické akosa udává v příklade 1. Příklad 3 Enteropatogénny kmeň Escherichia coliCCM 391.0 bol kultivovaný v 300 m! Erlen-mayerových bankách s obsahom 20 ml ste-rilného média, ktorého zloženie je na stra-ně 2 a ktoré obsahuje 0,5 % kyslého kazeí-nového hydrolyzáíu a 0,1 % glukózy. Ďalšiatechnologická příprava a spracovanie bio-masy uvedeného kmeňa je analogické akosa udává v příklade 1. Přiklaď 4 Enteropatogénny kmeň Escherichia coliCCM 3909 bol kultivovaný v 300 ml Erlen-mayerových bankách s obsahom 20 ml ste-ří’něho média, ktorého zloženie je na stra-ně 2 a ktoré obsahuje 0,3 % kyslého kazeí-nového hydrolyzáíu a 0,1 % glukózy. Ďal-šia technologická příprava a spracovaniebiomasy uvedeného kmeňa je analogické a-ko sa udává v příklade 1. P R E D Μ E T

   1. Inaktivovaná vakcína proti neonatál-nej koli hnačke teliat, vyznacujuca sa tým,že obsahuje 1 X 1010 až 3 X 10í0 inaktivo-vaných kmeňov mikroorganizmov Escheri-chia coli CCM 3908, CCM 3909, CCM 3910,CCM 3911 v 1 ml vakcíny.
2. 2. Inaktivovaná vakcína podlá bodu 1, sa VYNALEZU vyznačuje tým, že kmene mikroorganizmovvo vakcíne sú minimálně z 90 % opilusova-né.
3. 3. Inaktivovaná vakcína podlá bodov 1 a 2,vyznačujúca sa tým, že jednotlivé kmeneEscherichia coli sú vo vakcíne zastúpené vrovnakom objemovom pomere.