CS250444B1

CS250444B1 - Způsob přípravy pepti ΊΊ na bázi molekuly kyse’iny pressinové

Info

Publication number: CS250444B1
Application number: CS808285A
Authority: CS
Inventors: Vaclav Cerovsky
Original assignee: Vaclav Cerovsky
Priority date: 1985-11-11
Filing date: 1985-11-11
Publication date: 1987-04-16

Abstract

Vynález se týká způsobu přípravy peptidů na bázi molekuly kyseliny pressinové obecného vzorce I Z—Cys—Tyr—Phe—Gin—Asn—Cys—N2H2PÍ] Bzl Bzl (I) přičemž Z je benzyloxykarbonylová chránící skupina, Bzl je benzylová chránící skupina, N2H2PI1 je fenylhydrazidová chránící skupina. Podstatou vynálezu je, že na chráněné aminokyseliny nebo peptidy tvořící fragmenty molekuly kyseliny pressinové, působí proteolytickými enzymi, papainem pro syntézy peptidových vazeb Tyr—Phe, Gin—Asn, chymotrypsinem pro syntézu peptidových vazeb Tyr—Phe, Phe—Gin a termolysinem pro syntézu peptidové vazby Tyr—Phe. Tento způsob přípravy poskytuje čistší produkty, je flexibilnější při volbě syntetického postupu a je i ekonomicky výhodnější, než postupy pro tento účel dosud používané.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy peptidů na bázi molekuly kyseliny pressinové a je založený na tom, že se pro tvorbu peptidových vazeb používá proteolytických enzymů.

Již dříve bylo zjištěno, že se proteolytické enzymy, jejichž vlastní funkci v živé hmotě je hydrolýza peptidových vazeb, mohou za určitých podmínek používat i k reakci opačné, tzn. k syntéze peptidových vazeb (přehled viz: Brtník F., Jošt K.: Chem. listy 74, 951 /1980/, Fruton J. S.: Adv. Enzymol. 53, 239 /1982/}, Jakubke II. — D. Kuhl P., Kěnnecke A.: Angev. Chem. 24, 85 /1985/).

Syntéza peptidů na bázi molekuly oxytocinu pomocí proteolytických enzymů je známa (čs. autorské ovědčení č. 244 645). Zde je popsána papainem katalyzovaná syntéza peptidových fragmentů Cys—Tyr a Asn—-Cys, které jsou společné pro sekvenci molekuly oxytocinu i kyseliny pressinové.

Nyní bylo zjištěno, že tento způsob syntézy je výhodný 1 pro syntézu N-koncového chráněného hexapeptidu vasopressinu a dalších strukturních fragmentů kyseliny pressinové. Tento způsob dává chemicky i opticky čisté produkty, provedení reakcí a zpracování vzniklých produktů je jednoduché a ekonomické.

Podstatou přípravy peptidů na bázi molekuly kyseliny pressinové obecného vzorce I je, že se na chráněné aminokyseliny nebo peptidy, tvořící fragmenty kyseliny pressinové, působí proteolytickými enzymy, papinem pro syntézu peptidových vazeb Tyr— —Phe, Gin—Asn, chymotrypsinem pro syntézu peptidových vazeb Tyr—Phe, Phe—Gin a termolysinem pro syntézu peptidové vazby Tyr—Phe.

Způsob přípravy chráněných peptidů sekvence kyseliny pressinové s využitím proteolytických enzymů se dále objasňuje v příkladech provedení.

Příklad 1

Fenylhydrazid terc.butyloxykarbonylfenylalanyl-glutaminu

K roztoku methylesteru terc.butyloxykarbonylfenylalaninu (430 mg) a trifluoracetátu fenylhydrazidu glutaminu (650 mg) ve směsi methanolu (4 ml) a 0,2 mol. I^-1 karbonát-bikarbonátového pufru pH 10,5 (16 mililitrů) byl po úpravě pH na hodnotu 10 přidán a-chymotrypsin (10 mgj a směs byla míchána 3 hodiny při teplotě místností. Vyloučená sraženina byla odfiltrována a zpracována běžným způsobem. Bylo získáno 39|5 mg (52 %] produktu o t. t. 200 až 202 stupňů Celsia. Krystalizací ze směsi methanolu a etheru bylo získáno 324 mg (43 %) o t. t. 202 až 203 ^qC.

[a]_D —11,4 (c 0,3, methanol).

Aminokyselinová analýza:

Glu 1,00, Phe 1,01,

Pro 'C25H33N5O5 . O . 5Ή2Ο (492,6) vypočteno:

60,95 % C, 6,96 % H, 14,21 % N;

f» o I ΟσρΐΎΑ ·

61,25 % C, 6,76 % H, 14,39 θ/ο N.

Příklad 2

Fenylhydrazid terc.butyloxykarbonylfenylalanyl-glutamlnylasparaginyl-S-benzylcysteinu

K roztoku terc.butyloxykarbonylfenylalanyl-glutaminu (200 mg) a trifluoracetátu fenylhydrazidu asparaginyl-S-benzylcysteinu (320 mg) ve směsi ethanolu (1,5 ml) a 0,2 mol.l^-1 acetátového pufru pH 5,8 (3,5 mililitru) byla přidána kyselina ethylendiaminotetraoctová (3 mg) a hydrochlorid cysteinu (5 mg). pH roztoku bylo 4,8. Po přidání papaínu (20 mg) byla směs inkubována 20 hodin při 38 °C. Vyloučená sraženina byla odfiltrována a zpracována běžným způsobem. Bylo získáno 345 mg (87 %) produktu o t. t. 228 až 229 °C. Krystalizací ze směsi methanolu a etheru bylo získáno 315 miligramů (80 %) o t. t. 229 až 230 °C.

[«]_D —35,9 (c 0,2, dimethylformamid).

Aminokyselinová analýza:

Asp 1,02, Glu 1,00, Phe 1,00, Cys(Bzl) 0,99, Pro C39H50N8O8S1. O . 5H2O (799,9) vypočteno:

58J56 % C, 6,43 % H, 14,01 «/o N;

nflloyonn'

58,43 «/o C, 6,21 % H, 13,87 % N.

Příklad 3

Fenylhydrazid terc.butyloxykarbonyltyrosyl-fenylalaninu

K roztoku terč. butyloxykarbonyltyrosinu (565 mg) a trifluoracetátu fenylhydrazidu fenylalaninu (815 mg) ve směsi ethanolu (4 ml) a 0,2 mol. I^-1 acetátového pufru pH 4,8 (16 ml) byla přidána kyselina ethylendiaminotetraoctová (6 mg) a hydrochlorid cysteinu (20 mg). Po úpravě pH na hodnotu 4,8 byl přidán papaln (85 mg) a směs byla inkubována 25 hodin při 38 °C. Produkt byl extrahován mnohonásobně do ethylacetátu a ethylacetátový roztok byl promýt HSOá^- pufrem pH 2, vodou, 0,5 mol. I¹NaHCO3, vodou, vysušen síranem sodným a odpařen. Odparek byl krystalován ze směsi ethylacetátu a petroletheru. Bylo získáno 370 mg (36 %) produktu o t. t. 203 až 205 “C. Vzorek pro analýzu byl rekrystalován z ethylacetátu, t. t. 207 až 208 °C.

5 β 4 4 4 [a]_D —3.1,9 (c 0,3, dimethylformamid).

Aminokyselinová analýza:

Tyr 0,93, Phe 1,07,

Pro C29H34N4O5 (518,6) vypočteno:

67,16 % C, 6,61 % H, 10,80 % N; nalezeno

66,88 O/o C, 6,55 % H, 10,56 «/o N.

Příklad 4

Methylester benzyloxykarbonyl-S-benzylcysteinyl-tyrosyl-fenylalaninu

K roztoku benzyloxykarbonyl-S-benzylcysteinyl-tyrosinu (51 mg) a hydrochloridu methylesteru fenylalaninu (25 mg) ve směsi dimethylformamidu (0,5 ml) a 0,2 mol. I“¹Tris-maleinanového pufru pH 7 (2 ml) byl přidán chlorid vápenatý (0,5 mg) apH bylo upraveno na hodnotu 7,0. Po přidání termolysinu (2 mg) byla směs inkubována 24 hodin při 38 °C. Směs byla okyselena 1 mol. . I“¹ HC1 a produkt byl extrahován do ethylacetátu. Ethylacetátový roztok byl promyt 1 mol. I^-1 HC1, vodou, 0,5 mol. l~^x vodou, vysušen síranem sodným a odpařen. Odparek byl rozetřen etherem. Bylo získáno 40 mg (60 %) produktu o t. t. 162 °C.

(a]_D —36,5 (c 0,3, methanol).

Aminokyselinová analýza:

Tyr 0,99, Phe 1,03, Cys(Bzl) 0,98.

Literatura uvádí t. t. 154°C, (a]_D —33,7 (c 1,5, methanol). (Boissonnas R. A., Guttmann St., Jaquenoud P. — A., Waller J. — P.: Helv, Chim. Acta 39, 1 421 /1956/).

Příklad 5

Fenylhydrazid benzyloxykarbonyl-S-benzylcysteinyl-tyrosyl-fenylalaninu (příprava termolysinem)

K roztoku benzyloxykarbonyl-S-benzylcysteinyl-tyrosinu (,51 mg) a trifluoracetátu fenylhydrazidu fenylalaninu (47 mg) ve směsi dimethylformamidu (0,5 ml) a 0,2 mol. .1^-1 Tris-maleinanového pufru pH 7 (2 ml) byl přidán chlorid vápenatý (0,5 mg) a pH bylo upraveno na hodnotu 7,0. Po přidání termolysinu (2 mg) byla směs inkubována 6 hodin při 38 °C. Vyloučená sraženina byla odfiltrována a zpracována běžným způsobem. Bylo získáno 70 mg (94 %) produktu o t. t. 243 až 245 °C. Krystalizací z methanolu bylo získáno 63 mg (84 %) produktu o t. t. 244 až 245 °C.

[«]□ —41,2 (c 0,3, dimethylformamid).

Aminokyselinová analýza:

Tyr 0,95, Phe 1,11, Cys(Bzl) 0,94.

Pro C42H4N35O6S1. O . 5H2O (754,9) vypočteno:

66,82 % C, 5,87 % H, 9,27 % N; nalezeno:

66,45 % C, 5,73 % H, 9,36 % N.

Příklad 6

Fenylhydrazid benzyloxykarbonyl-S-benzylcysteinyl-tyrosyl-fenylalaninu (příprava chymotrypsinem)

K roztoku ethylesteru benzyloxykarbonyl-S-benzylcysteinyl-tyrosinu (67 mg) a trifluoracetátu fenylhydrazidu fenylalaninu (185 mg) ve směsi dimethylformamidu (2,25 mililitru) a 0,2 mol. l~^x karbonát-bikarbonátového pufru pH 10,5 (2,75 ml) byl po úpravě pH na hodnotu 10 přidán a-chymotrypsin (5 mg) a směs byla míchána 1 hodinu při teplotě místnosti. Směs byla naředěna 1 mol. I^-1 HC1, vyloučená sraženina byla odfiltrována a zpracována běžným způsobem. Bylo obdrženo 62 mg surového produktu, který obsahoval zbytek výchozího dipeptidu. Krystalizací z methanolu bylo obdrženo 50 mg (54 %) homogenního produktu o t. t. 243 až 244 °C.

Aminokyselinová analýza:

Tyr 0,97, Phe 1,11, Cys(Bzl) 0,92.

Příklad 7

Fenylhydrazid benzyloxykarbonyl-S-benzylcysteinyl-tyrosyl-fenylalanyl-glutaminu

K roztoku benzyloxykarbonyl-S-benzylcysteinyl-tyrosinu (102 mg) a trifluoracetátu fenylhydrazidu fenylalanyl-glutaminu (110 miligramů) ve směsi dimethylformamidu (3 mililitry) a 0,2 mol. I^-1 Trismaleinanového pufru pH 7,3 (7 ml) byl přidán chlorid vápenatý (5 mg) (pH roztoku bylo 7,0) a termolysin (5 mg). Směs byla inkubována 20 hodin při 38 °C. Vyloučená sraženina byla odfiltrována a zpracována běžným způsobem. Bylo získáno 138 mg (79 %) produktu o t. t. 228 až 231 °C. Krystalizací z methanolu bylo získáno 124 mg (71 %) produktu o t. t. 231 až 233 °C.

(a]_u —27,6 (c 0,3, dimethylformamid).

Aminokyselinová analýza:

Glu 1,0, Tyr 0,9, Phe 1,0, Cys(Bzl) 0,9.

Pro C47H51N7O8S . IH2O (892,1)

S3 4 4 4 vypočteno:

63,27 % C, 5,99 % H, 10,99 % N;

nalezeno:

63,36 % C, 5,87 θ/ο H, 11,23 % N.

Příklad 8

Fenylhydrazid benzyloxykarbonyl-S-benzylcysteinyl-tyrosyl-fenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinu (příprava termolysinem 2 + 4)

K roztoku benzyloxykarbonyl-S-benzylcysteinyl-tyrosinu (102 mg) a trifluoracetátu fenylhydrazidu fenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinu (180 mg) ve směsi dimethylformamidu (3,5 ml) a 0,2 mol. 1^_1Trysmaleinanového pufru pH 7 (6,5 ml) byl přidán chlorid vápenatý (5 mg) (pH roztoku bylo 7,0) a termolysin (5 mg). Směs byla inkubována 20 hodin při 38 ^aC. Vyloučená sraženina byla odfiltrována a zpracována běžným způsobem. Bylo získáno 202 mg (86 °/o) produktu o t. t. 260 až 261 °C.

[aju —35,3 (0,2, diinethylformamid).

Aminokyselinová analýza:

Asp 1,07, Glu 1,10, Tyr 0,92, Phe 1,06,

Cys (Bzl) 1,71.

Pro C6iH6sNioOtiS2 . 31120 (1 235) vypočteno:

59,32 % C, 6,04 % H, 11,34 θ/ο N; nalezeno *

59,38 °/o C, 5,58 % H, 11,61 % N.

Příklad 9

Fenylhydrazid benzyloxykarbonyl-S-benzylcysteinyl-tyrosyl-fenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinu (příprava chymotrypsinem 3 + 3)

K roztoku benzyloxykarbonyl-S-benzylcysteinyl-tyrosyl-fenylalaninu (13,2 mg] a fenylhydrazidu glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinu (12 mg) ve směsi dimethylformamidu (0,3 ml) a 0,2 mol.l^-1 Trys-maleinanového pufru pH 7,0 (0,7 ml) byl přidán a-chymotrypsin (5 mg) a směs byla inkubována 20 hodin při 38 °C. Produkt byl zpracován stejným způsobem jak uvedeno výše. Bylo získáno 20 mg (85 %) produktu o t. t. 248 až 250 °C. Krystalizací z methanolu bylo získáno 15 mg (64 %) produktu o t. t. 258 až 260 °C.

[a]_u —34,4 (c 0,2, diinethylformamid).

Aminokyselinová analýza:

Asp 1,14, Glu 1,13, Tyr 0,92, Phe 0,95, Cys(Bzl) 1,71.

Příklad 10

Fenylhydrazid benzyloxykiarbonyl-S-beuzylcysteinyl-tyrosyl-fenylalanyl-giutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinu (příprava papainem 4 + 2)

K roztoku benzyloxykarbonyl-S-benzylcysteinyl-tyrosyl-fenylalanyl-glutaminu (16 mg) a trifluoracetátu fenylhydrazidu asparaginyl-S-benzylcysteinu (13 mg) ve směsi dimethylformamidu (0,3 ml) a 0,2 mol. I^-1acetátového pufru pH 4,8 (0,7 ml) byla přidána kyselina ethylendiaminotetraoctová (0,3 mg) a hydrochlorid cysteinu (1 mg). Po úpravě pH na hodnotu 4,8 byl přidán papain (2,1 mg) a směs byla inkubována 20 hodin při 38 °C. Produkt byl zpracován stejným způsobem jak uvedeno výše. Bylo získáno 15 mg (64 %) produktu o t. t. 248 až 251 °C. Krystalizací z methanolu bylo získáno 8 mg (34 %) produktu o t. t. 257 až 259 stupňů Celsia.

Aminokyselinová analýza;

Asp 0,97, Glu 1,08, Tyr 0,96, Phe 0,97, Cys(Bzl) 2,04.

Claims

Způsob přípravy peptidů na bázi molekuly kyseliny pressinové obecného vzorce I Z—Cys—Tyr—Phe—Gin—Asn—Cys—N2H2PI1

Bzl Bzl (I) přičemž Z je benzyloxykarbonylová chrániči skupina, Bzl je benzylová chrániči skuVYNÁLEZU pina, N2H2PI1 je fenylhydrazidová chránicí skupina vyznačený tím, že se na chráněné aminokyseliny nebo peptidy tvořící fragmenty molekuly kyseliny pressinové, působí proteolytickými enzymy, papainem pro syntézu peptidových vazeb Tyr—Phe, Gin—Asn, chymotrypsinem pro syntézu peptidových vazeb Tyr—Phe, Phe—Gin a termolysinem pro syntézu peptidové vazby Tyr—Phe.