CS245107B1 - Nový kmen houby Aspergillus niger CCM-F-749 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká průmyslového kmene (mutanty) houby druhu (species) Aspergillus niger van Thieghem CCM-F-749 s vysokou biochemickou aktivitou, který je schopen zkvašovat melasové substráty připravené běžnými postupy s výtěžkem kyseliny citrónové, který převyšuje produkci kyseliny citrónové při použití dosud užívaných kmenů. Mimo to je schopen s nesníženou aktivitou zkvašovat i vyšší vrstvy a koncentrace kvasného média a z produkovaných kvasných louhů, získaných z kvasného procesu za použití nového kmene, lze získat hotový produkt vyšší kvality a čistoty. Produkční mycelium nového kmene jeví při průmyslové aplikaci vyšší odolnost proti napadení infekční parazitickou houbou rodu Penicillium.

Description

243107

Vynález se týká průmyslového kmene (mu-tanty) houby druhu (species) Aspergillusniger van Thieghem s vysokou biochemickouaktivitou, který je schopen zkvašovat me-lasové substráty připravené běžnými postu-py s výtěžkem kyseliny citrónové, který pře-vyšuje produkci kyseliny citrónové při po-užiti dosud užívaných kmenů. Mimo to jeschopen s nesníženou aktivitou zkvašovati vyšší vrstvy a koncentrace kvasného mé-dia a 'z produkovaných kvasných louhů, zís-kaných z kvasného procesu za použití no-vého kmene, lze získat hotový produkt vyš-ší kvality a čistoty. Produkční mycelium no-vého kmene jeví při průmyslové aplikacivyšší odolnost proti napadení infekční pa-razitickou houbou rodu Penicillium.

Nový kmen produkuje vedle kyseliny ci-trónové i malé množství kyseliny oxalovév rozmezí 0 až 15 % hmot. na vytvořenoukyselinu citrónovou.

Vedlejší tvorbu kyseliny oválové možnoovlivnit přípravou a složením kvasného mé-dia tak, aby při zachování maximální pro-dukce kyseliny citrónové byla vedlejší tvor-ba omezena na nezbytné minimum, eventu-álně zcela potlačena.

Kmeny Aspergillus niger, které se použí-vají při výrobě kyseliny citrónové kvasnoucestou, jsou hodnoceny především z hledis-ka jejich produktivity, tj. intenzity přeměnynasazené cukerné složky média na žádanýmetabolit — kyselinu citrónovou. Dalšímpředpokladem úspěšného využití zvolenéhokmene je možnost získání potřebného množ-ství očkovacího materiálu, tedy dostatečnáprodukce konidií při kultivaci kmene navhodné sporulační půdě.

Mezi průmyslově využívanými kmeny jsouvýznačné rozdíly nejen v intenzitě probíha-jících biologických procesů (rychlost klí-čení, tvorba a charakter myceliární hmoty,metabolická přeměna cukerné složky, tvor-ba vedlejších kyselin), ale produktivnostkmenů je také výrazně ovlivňována vlast-nostmi a složením produkčního média, cožse projevuje zvláště u kmenů, které se po-užívají pro kvasné zpracování melasovéhocukru.

Je známo, že u melas še projevují značnérozdíly jejich vhodnosti pro přípravu pro-dukčního média fc výrobě kyseliny citrónové,což je dáno vlivem jejich složení a souvisís rozdílným obsahem stimulátorů nebo in-hibitorů citrónového kvašení. Rozhodujícíje i způsob přípravy kvasného média, kdyvhodný technologický provozní postup za-ručí maximální produkci kyseliny citróno-vé, odpovídající možnostem použitého kme-ne.

Obecně lze soudit, že kmeny, které vedlekyseliny citrónové tvoří i vedlejší kyseliny(oxalová, glukonová), jsou méně vhodné amohou působit potíže při dalším zpracováníkvasných louhů na hotový produkt. Rozho-dující ale pro posouzení vhodnosti kmeneje kritérium produkce kyseliny citrónové.

Pokud jeden kmen s vedlejší tvorbou cizíchkyselin převyšuje produkcí kmen druhý, kte-rý sice vedlejší kyseliny netvoří, ale množ-ství a výtěžnost je nižší, volí výrobce v zá-sadě kmen zaručující vyšší výrobu kyselinycitrónové a upravenou technologií eliminu-je nežádoucí obsah cizích kyselin v prokva-šeném substrátu v průběhu jeho zpracování.

Dosud používaný nejlepší produkční kmenL-l tvoří na melasách zpracovaných pro-vozním technologickým postupem 60 až 70procent hmot. kyseliny citrónové (podle kva-lity zpracovávané melasy) počítáno na na-sazený cukr. Prodloužením doby kvašení ne-ní schopen efektivně bez výrazného' sníženívýtěžnosti prokvasit vyšší vrstvu kvasnéhomédia než 9 cm.

Nový produkční kmen U 47 byl získánmutagenním působením UV světla na paren-tální kmen H 16. Získaná mutanta N 47se liší od parentálníhO kmene H 16 v ná-sledujících fyziologických vlastnostech: a) % výtěžku kyseliny citrónové z poku-sů s melasovým substrátem (rozptyl výtěž-nosti podle druhu melasy): H 16 60 až 70 % hmot. KC na nasazený cukrU 47 85 až 90 % hmot. KC na nasazený cukr b) tvorba kyseliny oxalové (% hmotnostina vytvořenou kyselinu citrónovou): H 16 15 až 20 % hmot. U 47 3 až 8 % hmot. c) hmotnost mycelia bez výraznějšího· roz-dílu, mycelium kmene U 47 jeví vysokouodolnost proti infekční houbě Penicillium, d) uvedené parametry jasně prokazujírozdílnost ve fyziologických projevech zís-kané mutanty, které jsou výhodnější proprovozní využití tohoto kmene ve výroběkyseliny citrónové, především zvýšenou vý-těžností kyseliny citrónové a potlačenímvedlejší tvorby kyseliny oxalové na přija-telnou úroveň.

Pro pěstování kmene U 47 se osvědčilaglycerinová sporulační půda tohoto složení:125 g glycerinu, 45 g sladového extraktu,15 g Nad, 0,5 g NH4NO3, 0,06 g MgSOá aq,0,0015 CuSCU aq a 30 g agaru na 1 litr půdy.Po 8 dnech růstu na této půdě při kultivačníteplotě 32 °C kmen U 47 vytváří souvislýsporulující porůst kultury s délkou konidio-forů 2 až 3 mm, konidiální hlavice středněvelká, tmavě zbarvená. Po celém obvodujsou tvořeny primární sterigmata o délce 20až 30 μΐη a od třetího dne dochází na krat-ších (6 až 10 jum) sekundárních sterigma-tech k tvorbě řetězců konidií, které jsou ku-lovitého tvaru o průměru 3 až 4 μΐη, hlad-ké, tmavě hnědé barvy až černé barvy.

Po pětidenní kultivaci (32 °C) na stejné půdě se vytváří obří kolonie o průměru 60 až 65 mm s nesporulující okrajovou zónou 3 až 5 mm. 243107

Parentální kmen H 16 za stejných pod-mínek vytváří delší konidiofory 3 až 4 mm,primární a sekundární sterigmata jsou bezrozdílů proti U 47, vývoj řetězců konidií ve-likosti 3 až 4 pm je bohatší, barva konidiíje tmavohnědá. Starší kultury (od 8. dne)na rozdíl od U 47 jeví sklon k vytváření ste-rilních druhotných hyf (šedivění kultury).

Obří kolonie u ikmene H 16 dosahujevzhledových a rozměrových parametrů U 47o 20 až 24 hodin dříve.

Kmen U 47 nevyžaduje speciální přípravukvasného melasového média a k jeho apli-kaci lze použít běžně používaných techno-logických postupů přípravy (2, 3, 4, 5). Pro kmen U 47 se osvědčila sporulační glyceri-nová půda, používaná pro současný provoz-ní kmen L-l. Všeobecně používaná praxe je srovnávatzískaný nový kmen buď s parenterálnímkmenem, ze kterého byl získán, pro provoz-ní aplikaci a využití je vhodnější srovnánís dosud používaným kmenem ve výrobě.

Nový kmen U 47 předčí produkcí kyselinycitrónové jak současný provozní kmen L-l(o 10 až 15 % hmot. výtěžnosti), tak paren-tální kmen H 16 za současného sníženívedlejší tvorby kyseliny oxalové. Přednostikmene U 47 vyplývají z následující tabulkyčíslo 1.

Kmen

Laboratorní podmínky kvašení kyselina oxalová/ výtěžek KC /kyselina citrónová(°/o hmot.) (% hmot.)

Provozní podmínky kvašení kyselina oxalová/ výtěžek KC /kyselina citrónová(% hmot.) (% hmot.) L-l 70,2 0 H-16 65,0 6,4 U 47 89,3 2,7

Množství vytvořené kyseliny oxalové mož-no ovlivnit složením kvasného média, např.změnou dávky kyseliny fosforečné, hexa-kyanoželeznatanu draselného nebo změnouv postupu přípravy melasového média.Kmen pracuje spolehlivě v rozmezí při sub-strátu 6 až 7 a širokém rozmezí dávek he-xakyanoželeznatanu draselného.

Nový kmen je schopen prokvasit melaso-vý substrát s obsahem 14 % hmot. cukru 68,3 0 61,9 17,1 82,8 8,1 ve vyšší výšce než obvyklých 9 cm, s vyššíefektivností než současně používaný kmenL-l. Vedle této schopnosti se jeví i jakovhodnější pro zkvašování substrátů s vyššíkoncentrací cukru, než je obvyklých 14 %hmot.

Vlastnost nového kmene v průběhu stejnédoby kvašení (9 dnů) zkvašovat vyšší vrst-vy melasového substrátu vyplývá z výsled-ků uvedených v tabulce č. 2. a) Výtěžnost kyseliny citrónové v % hmot.Výška substrátu (cm) 9 10 11 12 kmen L-lkmen U 47 63,6 61,2 57,0 75,1 74,2 68,0 55,5 66,0 b) množství vytvořené kyseliny citrónové (g/ma za 1 den) výška substrátu (cm) 9 kmen L-l 953 kmen U 47 1126

Na sporulační půdě (4) roste nový pro-dukční kmen U 47 při teplotě 32 až 35 °Cvelmi dobře a po 8 až 9 dnech kultivace vy-tváří hustý koberec sporulujícího mycelias bohatou tvorbou konidií, které lze snadnomechanickým seškrabáním nebo odsátímoddělit. Konidie lze konzervovat buď ve ste-rilním písku, nebo ve vypraném sterilnímkarborafinu. V průběhu růstu na začátkukultivace ještě nesporulující mladé myce- 10 11 12 1 023 1 053 1 110 1 240 1 257 1 320 lium je zbarveno žlutým pigmentem, kterýje secernován i do kultivační půdy.

Konidiofory kmene jsou 2 až 3 mm dlou-hé, konidiální hlavice středně velké, černé.Kulaté vesikle nesou paprskovitě po celémobvodu primární sterigmata o délce 20 až30 jum, na kratších sekundárních sterigma-tech (6 až 10 μΐη) se vytváří řetězce koni-dií, které jsou kulovité, hladké, tmavě hně-dé až černé, o průměru 3 až 4 ftm,

Claims (1)

1. 245107 Nový produkční kmen CCM-F-749 byl zís-kán mutagenním působením UV světla vdávce 20 000 argů/mm2 na spory parentální-ho kmene. Po provedených selekcích a pro- dukčních testech monosporicikých kultur by-la získána nejaktivnější mutanta a označenajako kmen U 47. pSedmEt vynalezu Nový kmen Asperglllus niger van Thieghem CCM-F-749 vhodný pro průmyslovouprodukci kyseliny citrónové. Severografla, n. p., závod 7, Most Cena 2,40 Kčs