CS242609B1 - Způsob výroby přípravku pro zjišťování časného těhotenství a patologických stavů v gynekologii - Google Patents

Abstract

Způsob výroby přípravku spočívá v tom, že se nejméně dva druhy zvířat imunizují čistým lidským preparátem choriogonadotropního hormonu,získané protilátky se testují během imunisace sérovými a močovými proteiny netěhotných žen, potom se vyberou zvířata, která produkují protilátky s nejnižším stupněm zkřížené reakce, od kterých získané protilátky se podrobí reakci s močovými a sérovými proteiny netěhotných žen a přečištěné protilátky, získané nejméně od dvou druhů zvířat, se testují v sendvičovém uspořádání se vzorkem s nulovým obsahem choriogonadotropního hormonu a se vzorkem s obsahem nejméně 1 IU choriogonadotropního hormonu na ml vzorku.

Description

Způsob výroby přípravku pro zjišťování časného těhotenství a patologických stavů v gynekologii

Způsob výroby přípravku spočívá v tom, že se nejméně dva druhy zvířat imunizují čistým lidským preparátem choriogonadotropního hormonu,získané protilátky se testují během imunisace sérovými a močovými proteiny netěhotných žen, potom se vyberou zvířata, která produkují protilátky s nejnižším stupněm zkřížené reakce, od kterých získané protilátky se podrobí reakci s močovými a sérovými proteiny netěhotných žen a přečištěné protilátky, získané nejméně od dvou druhů zvířat, se testují v sendvičovém uspořádání se vzorkem s nulovým obsahem choriogonadotropního hormonu a se vzorkem s obsahem nejméně 1 IU choriogonadotropního hormonu na ml vzorku.

242 609

- 2 242 609

Vynález se týká způsobu výroby specifického přípravku pro zjišťování časného těhoteství a diagnostiky a sledování některých patologických stavů, spojených s výskytem lidského choriového gonadotropinu v tělních těkutinách, k jeho detekci a kvantifikaci v moči, séru či plasmě metodou Enzyme Linked Immunosorbent Aásay sendvičového typu - protilátka, antigen, značená protilátka.

Lidský choriový gonadotropin je glykoproteinový hormon fyziologicky produkovaný placentou. Hormon se objevuje v periferním oběhu /sérum, plasma a následně moč/ asi 9 dní po koncepci a jeho hladina postupně stoupá. Průkaz choriového gonadotropinu tedy znamená průkaz těhotenství, přičemž čím citlivější je metoda průkazu, tím dříve lze těhotenství zjistit. Včasné zjištění těhotenství má značný medicínský význam. Krom vlastní informace pro ženu a lékaře je nezbytné u různých těhotenských patologií např. mimodšložního těhotenství a dalších. Kvantitativní stanovení choriového gonadotropinu jě velmi důležité při sledování ohroženého těhotenství a při sledování terapie hCG produkujících nádorů. Včasné a spolehlivé rozpoznání těhotenství je též nutné pro široké zavedení metody tzv. mini-interrupce, tj. indukovaného umělého přerušení těhotenství v nej časnějším stadiu.

V současné době se používají pro stanovení těhotenství zkoušky, které jsou založeny na metodě zábrany hemaglutinace. Nevýhodou těchto testů je především jejich nízká citlivost, umožňující zjištění těhotenství nejdříve v období kolem 40'. dne cyklu, dále jejich použitelnost pouze pro testy v moči a nemožnost přímé kvantifikace choriového gonadotropinu. Kromě těchto testů jsou známé testy na basi latexové, které trpí stejnými nevýhodami a jsou vhod né především pro rychlé orientační vyšetření. Dále existují vysoce citlivé testy na baxi tzv. rádioimunoeseje. Tyto soupravy jsou

242 609 samy o sobě velmi nákladné, krom toho však vyžadují ještě nákladné vyhodnocovací zařízení, tj. počítač impulsů. Soupravy mají vel mi krátký čas použitelnosti a práce s radioaktivním materiálem představuje zdravotní riziko.

Možnost použití imunoenzymatické metody pro zjištění choriového gonadotropinu je již déle známa. Princip sendvičové metody spočívá v tom, že prvá protilátka se váže na imunosorbent, napřík lad na stěnu polystyrénové zkumavky. Poté se zkumavka promyje, odstraní se všechny nenavázané molekuly protilátky. Přidá se vzorek s obsahem choriogonadotropního hormonu - antigenu, který se váže na imobilizovanou protilátku. Zkumavka se opět promyje. Přidá se druhá, enzymem značená protilátka, která se váže na antigen z druhé strany molekuly a zkumavka se promyje. Přidá se substrát s bezbarvým chromogenem - dochází k rozkladu substrátu enzymem, což způsobí zbarvení chromogenu. Reakce se po určité době zastaví Barevná reakce ve zkumavce tedy znamená, že byl přítomen vyšetřovaný antigen. Nezbarveny obsah svědčí o nepřítomnosti antigenu. Intenzita zbarvení koresponduje s koncentrací antigenu. Závislost absorbance na koncentraci antigenu lze vyjádřit kalibrační křivkou, z níž je možno zpětně odečítat z naměřené absorbance hledané množství antigenu. Základní principy zpracovali v hrubé formě B.K.Van Weemen a A.H.W.M. Schuurs /Van Weemen, B.K. Schuurs,

A. H.W.M., FEBS Letters 15 /3/, 1971, s. 252 až 256; Van Weemen,

B. K., Schuurs, A.H.W.M., FEBS Letters 45 /2/, 1974, s. 215 až 218/. Řada novějších, vysoce kvalitních experimentálních prací též není vhodná pro praktické rutinní použití /Hamada, K. et al., Endocrinol. Japon. 25 /5/, 1978, s. 515 až 517; Iwasa, S. et al., J. Biochem. 89 /4/, 1981, s. 1091 až 1099; Tomoda, S. et al., Endocrinol. Japon. 27 /6/, 1980, s. 785 až 788; T. et al., Acta Endocrinol. /KbH/, 97, 1981, s. 562 až 568/. Kompetitivní ELISA test uvedený U.M. Joshi /Joshi, U.M. et al., Obstet. Gynec., 57 /2/, 1981, s. 252 až 254/ je vhodný pro rutinní použití, má však poměrně nízkou citlivost a není blíže precizována specifita testu. Kvalitní imunoenzymatický test /Mohta, H.C., MacDonald, D.J., Glin, Chim. Acta 121, 1982, s. 245 až 250/, který používákomerční protilátku proti beta podjednotce choriového gonadotropinu, je vysoce specifický, ale příprava protilátky proti beta podjed-A 242 609 notce je poměrně složitá, což by se projevilo v případě komerční výroby ve zvýšených nákladech na jedno vyšetření.

Lidský choriový gonadotropin se skládá ze dvou neidentických podjednotek, nazvaných alfa a beta, přičemž alfa podjednotka je téměř identická s alfa podjednotkami dalších hormonů, především s luteinisačním hormonem, zatímco beta podjednotka je pro choriogonadotropní hormon specifická. Imunizace celou molekulou choriogonadotropinu je sice velmi jednoduchá a levná, neboť preparát není třeba speciálně upravovat, vede však k téměř úplné zkřížené reakci protilátek s luteinisačním hormonem. Zatímco choriogonadotropní hormon je specificky těhotenský, vyskytuje se luteinisační hormon v poměrně vysokých hladinách u netěhotných. Test využívající takovouto protilátku pak není vhodný pro průkaz těhotenství - a to alespoň ne v časném stadiu, kdy hladiny choriogonadotropinu nepřevyšují hladiny luteinisačního hormonu. Těhotenství je mož no určit až v pozdějším stadiu, kdy již hladiny choriogonadotropinu jsou již dostatečně vysoké.

Tuto nevýhodu lze obejít imunizací pouze specifickou beta podjednotkou hormonu. Vzniklá antiséra pak jsou schopna částečně specifické reakce s choriogonadotropinem v přítomnosti luteinisačního hormonu - tj. preferenčně reagují. Stupeň specifické reakce se u různých antisér individuálně liší. Problém tohoto postupu spočívá ve velice náročné izolaci beta podjednotky choriového gonadotropinu, která je značně nákladná, a dále v tom, že imunizace zvířat vede pouze zřídka k tvorbě specifické protilátky.

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob výroby přípravku, který spočívá v tom, Že se nejméně dva druhy zvířat imunizují čistým lidským preparátem choriogonadotropního hormonu, získané protilátky se testují během imunisace se sérovými a močovými proteiny netěhotných žen, načež se vyberou zvířata, která produkují protilátky s nejnižším stupněm zkřížené reakce, od nichž získané protilátky se podrobí reakci s močovými a sérovými proteiny netěhotných žen a přečištěné protilátky reagující především s choriogonadotropním hormonem se získané nejméně od dvou druhů zvířat testují v sendvičovém uspořádání se vzorkem s nulovým obsahem chorio

242 809 gonadotropního hormonu a se vzorkem s obsahem nejméně 1HJ choriogonadotropního hormonu na 1 ml vzorku.

Účinek dle vynálezu spočívá v jednodušším způsobu přípravy specifických protilátek a jejich následné optimalizaci pro specifické zjištění nízkých hladin choriogonadotropního hormonu.

Výhodou uvedeného imunoenzymatického testu pro stanovení choriogonadotropního hormonu je jeho vysoká citlivost a specifita, srovnatelná s dováženými testovacími soupravami na basi radioimunoeseje, přičemž náklady na jedno stanovení jsou podstatně nižší, test má též delší .dobu upotřebitelnosti, řádově měsíce oproti týdnům, není nutné nákladné vyhodnocovací zařízení, postačí běžný spektrofotometr a odpadá riziko práce s radioizotopem. Uvedený imunoenzymatický test lze provádět v moči, kvalitativní stanovení a orientační kvantifikace, séru i plasmě, kvalitativní stanovení a kvantifikace, přičemž test lze provádět ve zdravotnických zařízeních všech stupňů a je proveditelný během jedné pracovní směny. Stanovení lze provádět nejen ve zkumavkách, ale též na mikrotitračních destičkách.

Předmět vynálezu blíže osvětluje následující příklad.

Příklad 1

Protilátky byly připraveny imunisací prasat a ovcí čištěným choriovým gonadotropinem o aktivitě 10 000 IU choriogonadotropního hormonu/mg. Jako adjuvans při imunizaci zvířat byla použita suspense hydroxidu hlinitého s parafinovým- olejem a sorbitan trioleatem. Získané protilátky byly testovány imunodifusí na stupeň zkřížené reakce zkříženě reagujícími hormony, především s luteini sačním hormonem a dále na stupeň reakce s močovými a sérovými bil kovinami a byla vybírána antiséra s nejnižším stupněm zkřížené reakce. Tyto testy byly prováděny již během imunizace a nevyhovující zvířata byla vyřazována. Získaná kvalitní antiséra byla vysycena na kolonách obsahujících s výhodou agarosum gel s navázanými močovými proteiny, které byly izolovány z velkého počtu mužské moče - 500 dárců a moče žen v postmenopause. Takto se zbavila antiséra molekul protilátek zkříženě reagujících s močovými pro- 6 242 609 teiny, které vznikly imunitní reakcí proti malému množství kontaminujícího materiálu, přítomného i ve vysoce čistém preparátu. Protože zkříženě reagující luteinisační hormony jsou v moči přítomny, dojde použitým postupem, nejen k potlačení nespecifických interakcí, ale i zkřížené reakce proti těmto hormonům. Antiséra byla dále vysyco.vána na koloně obsahující na pevné fázi na CNBr Sepharosu 4B navázané proteiny získané ze séra a moče netěhotných žen.

Získaná přečištěná séra obsahující především protilátky reagující s choříogonadotropním hormonem se vzájemně kombinovala společně se vzorky neobsahujícími choriogonadotropní hormon a se vzorky s obsahem 1 U chořiogonadotropinu/ml. Byly vybrány kombinace protilátek, které měly absorbanci se vzorkem s nulovým obsahem choriogonadotropinu nižší než 0,2 jednotky a se vzorkem s obsahem 1 IU choriogonadotropinu/ml vyšší než 1,0 jednotka absorbance. Jako protilátka I byla vybrána prasečí protilátka, která vykazovala citlivost 6m IU choriogonadotropinu/ml. Ovčí protilátka byla testována se vzorkem obsahujícím 20 mlU choriogonadotropinu/ml a 20 mlU luteinisačního hormonu/ml a vykazovala 4krát vyšší citlivost vůči choriogonadotropinu oproti luteinisačnímu hormonu.

Na tuto II. protilátku byla navázána peroxidása.

Sestrojená kalibrační křivka vyjadřovala lineární závislost absorbance na koncentraci v rozmezí 10 až 1 000 mlU choriogonadotropinu/ml. Obdobně byla připravena kombinace protilátek imunisací králíků a ovcí.

Protilátky byly součástí soupravy na detekci a kvantifikaci hCG. Souprava obsahovala 5x20 ml lyofilizované protilátky I a 1 dávku koncentrované specifické protilátky II značené peroxidazou, 5x1 ml lyofilizováného srovnávacího přípravku choriogonadotropinu jako standard, 15 ml vazebního roztoku lOOx koncentrovaného, kterým je bikarbonátový pufr alkalického pH, 100 ml promývacího roztoku 20x koncentrovaného, který obsahuje detergent, lx 50 ml ředicího roztoku I k ředění protilátky II a 250 ml ředicího roztoku II k ředění vzorků, 60 ml substrátového roztoku a 6x10 mg 0-fenylendiaminu v homogenní směsi s 90 mg síranu draselného.

- 7 242 609

Jako nosič bylo dodáno 5 kusů polystyrénových destiček s 96 jamkami na každé destičce. Možno též použít polystyrénové zkumavky.

Souprava je určena k detekci a semikvantitativnímu stanovení lidského choriového gonadotropinu v moči a kvantitativnímu stanovení v séru. Vyšetření je založeno na principu Enzyme Linked Immunosorbent Assay. Na stěny jamek se naváže prasečí protilátka I a po vypláchnutí se do jamek aplikují standardní a vyšetřované vzorky. Je-li ve vzorcích přítomen choriogonadotropin, váže se během inkubace na navázanou protilátku. Po vymytí se aplikuje peroxidázou značená ovčí protilátka II. Značené protilátka se naváže na antigen - choriogonadotropní hormon. Po vymytí se provede detekce peroxidázové aktivity, která je úměrná koncentraci antigenu ve vzorku. Výsledky zkoušky jsou známy asi za 6 hodin.

Pro zjištění stupně zkřížené reakce bylo použito sto vzorků ranních močí zdravých žen v menopause ve věku od 45 do 60 let.

Moč těchto žen obsahuje zvýšené množství zkřížené reagujících hormonů, které by mohly v neznámém vzorku způsobit chybnou interpretaci výsledku testu ve smyslu falešné pozitivity. Po statistickém. zhodnocení celého souboru testovaného imunoenzymatickou metodou je určena hladina, kterou již zkříženě reagující hormony nemohou s vysokou pravděpodobností překročit, přičemž zjištění hladin vyšších v neznámém vzorku lze již považovat za specifické” zjištění choriogonadotropinu. Tato hladina odpovídá v séru, plasmě i moči 200 mlU choriogonadotropinu/ml vzorku, přičemž hladiny mezi 50 až 200 mlU ch®riogonadotropinu/ml lze považovat za možné těhotenství, proto je označujeme jako přechodné a test následující den opakujeme. Uvedená specifická hladina pokrývá i preovulační vzestup zkříženě reagujících hormonů v menstruačním cyklu.

K provedení testu se používá běžné laboratorní vybavení vodní či motorové vývěvy a běžných spektrofotometrů, schopných měřit 1 ml vzorku při 492 nm s přesností na dvě desetinná místa, například Spekol 10.

I

-|δ Příklad provedení testu; ^{242 609}

Vzorky ranních močí zdravé 281eté ženy, která plánovala otěhotnění byly testovány v průběhu menstruačního cyklu. Menstruační cyklus byl pravidelný - 29 dní, žena již porodila jedno zdravé dítě. Vzorky močí byly testovány následovně:

lyofilizovaná protilátka proti hCG byla rozpuštěna ve vazebním roztoku, kterým je bikarbonátový pufr alkalického pH. Do polystyrénových zkumavek o objemu 3 cm5 bylo pipetováno vždy 0,3 ml rozpuštěné protilátky do jedné zkumavky. Za 20 hodin při teplotě +4 °C, inkubace do druhého dne v lednici, bylo ukončeno navázání protilátek na stěny zkumavek.

Roztok byl vysát ze zkumavek a každá zkumavka 3* promyta vazebným pufrem. Poté byly do zkumavek aplikovány standardní a vyšetřované vzorky močí, vždy 0,2 ml., a zkumavky byly uloženy na 2,5 hod. do termostatu vyhřátého na 37 °C.

Obsah zkumavek byl odsát, zkumavky 2x promyty roztokem obsahujícím' detergent, aby se zablokovaly zbylé volné vazebné skupiny.

Do každé zkumavky bylo aplikováno 0,2 ml roztoku druhé protilátky, která je značena enzymem. Zkumavky byly inkubovány v termostatu při 37 °C 1,5 hod.

Obsah zkumavek byl odsát a zkumavky 4x promyty roztokem obsahujícím detergent. Do zkumavek bylo aplikováno 0,2 ml 0,1% roztoku o-fenylendiaminu v pufru obsahujícím peroxid vodíku a zkumavky byly inkubovány 40 min. při 37 °C. U pozitivních vzorků dojde k rozkladu peroxidu vodíku enzymem, což se projeví barevnou reakcí. Reakce byla zastavena přidáním 1 ml 0,5 N kyseliny sírové do každé zkumavky. Výsledek se určuje fotometričky stanovením absorbance standardních a neznámých vzorků a vyhodnocuje, jak uvedeno výše.

Ve sledovaném cyklu bylo těhotenství zachyceno 29. den cyklu, kdy se hladina chořiogonadotropinu pohybovala v oblasti přechodných” výsledků a těhotenství bylo následně verifikováno 30. den cyklu, kdy byl již výsledek pozitivní.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob výroby přípravku pro zjišťování časného těhotenství a patologických stavů v gynekologii, porodnictví a onkologii spojených s produkcí lidského choriového gonadotropinu imunoenzymatickou metodou sendvičového typu, vyznačující se tím, že se nejméně dva druhy zvířat imunizují čistým lidským preparátem choriogonadotropního hormonu, získané protilátky se testují během imunisace sérovými a močovými proteiny netěhotných žen, načež se vyberou zvířata, která produkují protilátky s nejnižším stupněm zkří žené reakce, od nichž získané protilátky se podrobí reakci s močovými a sérovými proteiny netěhotných žen a přečištěné protilátky, získané nejméně od dvou druhů zvířat, se testují v sendvičovém; uspořádání se vzorkem s nulovým obsahem choriogonadotropního hormonu a se vzorkem s obsahem nejméně 1 IU choriogonadotropního hormonu na ml vzorku.