CS242220B1 - Sposob navázovania vysokomolekulových biologicky aktívnych látok na polytetrafluóretylénový povrch kovalentnou chemickou vazbou - Google Patents

Description

242220

Vynález sa týká sposobu navazovania vy-sokomolekulových biologicky aktívnych lá-tok (VBAL), akými sú například specificképrotilátky gama globulínovej povahy na po-lytetrafluóretylénový (PTFE) povrch kova-lentnou chemickou vazbou s dalším použitímv rádioimunoanalýze (RIA) alebo enzýmo-imunoanalýze (EIA).

Doležitým krokom pri RIA alebo EIA jeseparácia volnej a viazanej frakcie stanovo-vané] látky s jej protilátkou. K tomuto úče-lu sa využívá vačšinou precipitačných čini-diel na bielkovinovú frakciu, akými sú síranamónny a polyetylénglykol. Ďalej sa využíváimunoprecipitácie s druhou protilátkou. I-ným separačným postupom je možnost vy-užitia sorpcie nízkomolekulových látok naaktívnom uhlí potiahnutom dextranom. Tie-to postupy sú nevýhodné v tom, že po při-daní separačného činidla je potřebné via-zanú a volnú frakciu oddělit centrifugáciou,čo značné komplikuje postup a predlžujejednotlivé stanovenia. Preto sa k separáclistále vo vačšej miere používá tzv. pevnej fá-zy, t.j. protilátka je před samotnou imuno-chemickou reakciou zakotvená na pevnejfáze, vačšinou fyzikálnou adsorpciou. Proti-látka može byť naviazaná například na skú-mavke alebo gufke z - polypropylénu, poly-styrénu a pod. Vlastná separácia je po pře-běhnutí imunochemickej reakcie velmi jed-noduchá — naviazaná stanovovaná látka naprotilátku zostáva na pevnej fáze. Tento po-stup má výhodu oproti predchádzajúcim vovačšej rýchlosti vlastnej analýzy, nevýhodouje, že vazba na povrch nie je příliš stabilnáa naviazanú VBAL je potřebné chránit skla-dováním pri nízkej teplote (problémy pritransporte], alebo robit naviazanie tesnepřed imunochemickou reakciou. Dalším mož-ným typom separácie pomocou pevnej fá-zy je naviazanie VBAL v tlmivom roztoku najemné suspenzie, například hydroxilovanéhodextranu. Táto pevná fáza sa do reakcie při-dává vo formě suspenzie a nevýhodou je za-radenie centrifugácie, respektive volnej se-dimentácie pevnej fázy do postupu RIA aEIA. Okrem toho chemikálie na přípravususpenzie sú vačšinou dovozové.

Uvedené nedostatky rieši postup podlá vy-nálezu, ktorého podstatou je, že PTFE po-vrch sa aktivuje v roztoku amoniaku vo vo-dě s koncentráciou 5 — 42 % obj. prídavkomkovového sodíka od 0,01 do 15,00 mol. dm.1pri teplote —40 °C až + 25 °C s následnýmpremytím destilovanou vodou a vnesenímtakto aktivovaných povrchov do roztoku 1--etyl- (3,3-dimetylamínopropyl) -karbodiimi-du (EDC) s koncentráciou od 10“3 do 30 g .. dm-3 v destilovanej vodě s pH v rozsahuod 4,0 do 6,5, ku ktorému sa přidá VBAL skoncentráciou od 2 do 100 mg. dm“3 s ná-sledným ponecháním v klude po dobu 2 až24 hodin pri teplote v rozmedzí od 2 °C do50 °C, vytiahnutím z roztoku, premytím vod-ným roztokom chloridu sodného s koncen- tráciou od 0,5 do 15,0 % hmot. osušením priteplote od 5 °C do 45 °C.

Použitím postupu podlá vynálezu sa dosa-hujú následovně účinky. Je vytvořená velmipevná vazba VBAL na PTFE povrch, tepel-ne málo labilná, takže sa výrazné predlžujeexspirácia tejto pevnej fázy. Protilátka napevnej fáze je vnášaná do reakčnej zmesia po přeběhnutí imunochemickej reakcie jemožné volnú a viazanú frakciu od seba od-dělit vybratím pevnej fázy z reakčnej zme-si, čo značné zjednodušuje celý postup. U-rýchlenie celého postupu pri RIA má za ná-sledok, že pracovník, ktorý vlastnú analýzurobí, je kratšiu dobu vystavený rádioaktív-nemu žiareniu. Ďalej sa šetria dovozové su-roviny. Příklad 1

Gulky z PTFE boli vnesené do kadičky, vktorej bol roztok amoniaku vo vodě s kon-centráciou 11 % obj. Do kadičky sa potompo častiach přidával kovový sodík s výsled-nou koncentráciou 7,5 mol. dm"3 pri teplo-te —10 °C. Po přeběhnutí reakcie boli gulkyz PTFE premyté destilovanou vodou a vne-sené do roztoku EDC vo vodě s koncentrá-ciou 10 g . dm“3 (destilovaná voda malapH = 5,2). Do roztoku sa vniesla protilátkaproti tyroxínu s koncentráciou gama globu-línu 50 mg. dm“3 a tam ponechaná v klude4 hodiny pri teplote 22 °C. Po vytiahnutí bo-li gulky opláchnuté roztokom chloridu sod-ného vo vodě s koncentráciou 10 % hmot.Gulky boli osušené pri teplote 22 °C. Potomboli použité pri RIA a EIA tyroxínu. Příklad 2

Postupovalo sa ako v příklade 1. Koncen-trácia amoniaku bola 42 % obj. a prídavoksodíka 15 mol. dm“3. Pevná fáza bola vne-sená do roztoku EDC v destilovanej vodě spH = 6,5, s koncentráciou 30 g. dm-3. Kon-centrácia protilátky proti progesterónu bo-la 100 mg . dm'3 a k prepláchnutiu sa použilroztok chloridu sodného vo vodě s koncen-tráciou 15 % hmot. Gulky boli osušené priteplote 45 °C. Příklad 3

Postupovalo sa ako v příklade 2. Koncen-trácia protilátky proti alfatoxínu Bi bola2 mg . dm-3. Příklad 4

Postupovalo sa ako v příklade 1. Na PTFEpovrch bola naviazaná protilátka proti digo-xínu s koncentráciou 10 mg .dm-3.Příklad 5

Postupovalo sa ako v přiklade 2. Končen-

Claims (2)

1. 242220 5 trácia kovového sodíka bola však 0,1 mol.. dm~3. Příklad 6 Postupovalo sa ako v příklade 1. Koncen- trácia EDC však bola 10-2 g. dm“3. Vlastnákonjugácia prebiehala pri
2. 2 °C 24 hodin. PREDMET Spósob navazovania vysokomolekulovýchbiologicky aktívnych látok na polytetraflu-óretylénový povrch kovalentnou chemickouvazbou pre následné použitie v rádioimuno-analýze alebo enzýmoimunoanalýze, vyzna-čený tým, že polytetrafluóretylénový povrchsa aktivuje v roztoku amoniaku vo vodě skoncentráciou 5 až 42 % obj. prídavkom ko-vového sodíka od 0,01 do 15,00 mol. dm“3pri teplote —40 až + 25°C s následným pre-mytím destilovanou vodou a vnesením taktoaktivovaných povrchov do roztoku 1-etyl- ynAlezu - (3,3-dimetylamínopropyl) karbodiimidu skoncentráciou od 10“3 do 30 g . dm-3 v des-tilované) vodě s pH v rozsahu od 4,0 do 6,5,ku ktorému sa přidá vysokomolekulová bio-logicky aktívna látka s koncentráciou od 2do 100 mg . dm“3 s následným ponechánímv kiude po dobu 2 až 24 hodin pri teplote vrozmedzí od 2 °C do 50 °C, vytiahnutím zroztoku, premytím vodným roztokom chlo-ridu sodného s koncentráciou od 0,5 do15,0 % hmot. a osušením pri teplote od 5 °Cdo 45 °C.