CS241262B1 - Polymernl mikročástice na bázi hydrofilnich monomerů a způsob jejich výroby - Google Patents

Abstract

Řešeni se týká polymernl mikročástice na bázi bydrofllnich monomerů sestávají z 25 až 99,5 % hmot. hydrofilnich monomerů, vybraných ze skupiny sestávajíc! z 2-hydroxyethylmethakrylatu. 2-hydroxyethylakrylátu Ž akož i odpovídajících monoeeterů *-diydroxyoligo(oxyethylenu) a kyseliny met- .akrylátové či kyseliny akrylové 2,5-dihydroxypropylmethakrylátu, N-monosubstituovaného akrylamidu, kde subetituent může být alkyl s 1 až 5 atomy uhlíku nebo hydroryalkyl s 1 až 6 atomy uhlíku, obsahující1 až 2 OH skupiny, 4-vinylpyridinu, 2-vinylpyridinu, alkylamidu a methakrylamidu, 0,1 až 40 f hmot. ionogennich komonomerů, vybraných ze skupiny sestávající z kyseliny methakrylové, kyseliny akrylové, kyseliny itakonové, malelnanhydridu, 2- (dietylamlno)ethyl-methakrylátu, 2-(dimethylamino)ethyl-methakrylátu, 2-(dimethy1- amino)ethýl-akrylátu, 2-(dlethylamino) ethylakrylátu, p-diethylaminostyxenu a t 2-methakry1oyloxyetbyltelmethylamonium chloridu, 0,1 až 45 % hmot. siíovadla vybraného ze skupiny sestávalioi z N,?'-metnylenbis(akrylamidu), n,”-ethylenbi3(akrylamidu) , 1,2.5-(triakryloyloxymethyl)propanu, 1,5,5-triakryloylhydrotriazinu, ethylendimethakrylatu, ethylendiakrylátu, 2,2-oxydiethyl-dlmethakrylátu, dimethakrylatů < ,* -dihydroxyderivátů oligoethylenů a 0,05 až 25 /5 hmot. kovalentní vazbou vázaného haptenu vybraného ze skupiny se? stávající z NŤmethakryloylglycylglycyl-Ní-dinitrofenyllyeinu, N-methakxyloylglycyl fenylalanyl- N -dinitrofenyllyeinu.a Nmethakryloylglycylleucyl-N -dinltrofenyllysinu a popřípadě 0,05 až 7,5 hmot. polymerizovatelné fluorescenční značky vy brané ze skupiny sestávající s dansylally laminu, N-fluoresoein-H-allylthiomočoviny a N-tetramethylrhodamin-N-allylthiomočoviny·

Description

Vynález se týká polymerních mikročástic na bázi hydrofilních monomerů obsahujících specifické skupiny usnadňující jejich detekci a umožňující vazbu protilátek, jakož i použití těchto mikročástic, především v imunologii a parazitologii a způsobu jejich výroby.

Dosavadní symtetické mikročástice se vyráběly polymerizací za přítomnosti iniciátorů či emulgátorů, které není možno ze vzniklé suspenze mikročástic beze zbytku odstranit. Dosud používané postupy také neumožňovaly získat polymerixací homogenní velikost partikulí. Rovněž nebyla popsána výroba mikročástic, obsahujících již zapolymerixované hapteny přesně definované struktury.

Jmenované nevýhody dosud známých mikročástic a používaných o Z ^V v v Z Z postupu výroby odstraňuje předmětný vynalez.

Předmětem vynálezu jsou polymerní mikročástice na bázi hydrofilní ch monomerů, obsahující specifické skupiny usnadňující jejich detekci a umožňující vazbu protilátek, vyznačené tím, že sestávají z 25 až 99,5% hmot. hydrofilních monomerů, vybraných ze skupiny sestávající z 2-hydroxyethy1-methakrylátu, 2-hydroxyethyl-akrylátu, jakož i odpovídajících monoesterů * ,^|v-dihydroxyoligo(oxyethylenu) a kyseliny methakrylové či kyseliny akrylové; 2,3-dihydroxypropylmethakrylátu, N-monosubstituovancho methakry1amidu, N-monosubstituovaného akrylamidu, Ν,Ν-disubstituovaného akrylamidu, kde substituent může být alkyl s 1 až 5 atomy uhlíku nebo hydroxyalkyl s 1 až 6 atomy uhlíku, obsahující 1 až 2 OH skupiny, 4-vinylpyridinu, 2-vinylpyridinu, akrylamidu a methakrylamidu, 0,1 až 40% hmot. ionogenních komonomerů vybraných ze skupiny sestávající z kyseliny methakrylevé, kyseliny akrylové, kyseliny itakonové, maleinanhydridu, 2-(diethylamino)ethy1-methakrylátu, 2-(dimethylamino)ethyl-akrylátu,

241 262

2-(dimethylamino)ethyl-akrylátu, 2-(diethylamino)ethy1-akrylátu, p-diethylaminostyrenu a 2-methakryloyloxyethyltrimethylamoniumchloridu, 0,1 až 45$ hmot. sítovadla vybraného ze skupiny sestávající z N,N-methylenbis(akrylamidu), N,N-ethylenbis(akrylamidu), 1,2,3-(triakryloyloxymethyl)propanu, 1,3,5-triakryloylhexahydrotriazinu, ethylendimethakrylátu, ethylendiakrylátu, 2,2-oxydiethy1-dimethakrylátu, dimethakrylátů * ,<·>-dihydroxyderivátů oligoetherů a 0,05 až 25$ hmot. kovalentní vazbou vázaného haptenu vybraného ze skupiny sestávající z N-methakryloylglycylglycyl-N-dtinitrofenyllysinu a N-methakryloylglycylfenylalanyl-N-dinitrofenyllysinu a N-methakryloylglycylleucyl-N-dinitrofenylysinu a popřípadě Q,05 až 7»5$ hmot. polymerixovatelné fluorescenční značky vybrané ze skupiny sestávající z dansylaliylaminu, N-fluorescein-N-allylthiomočoviny a N-tetramethylrhodamin-. N-allyithiomočoviny.

Způsob výroby mikročástic podle vynálezu spočívá v tom, že účinkem radikálů vzniklých ozářením se kopolymerixuje roztok složený z 1 až 10$ hmot. směsi monomerů a 90 až 99$ hmot. v.ody nebo její směsi s 0 až 20% obj ' C^-C^ alkoholů nebo jinéllQ s vodou mísitelného rozpouštědla, přičemž monomerní směs je složena z 25 až 99,5$ hmot. hydrofilního monomeru (hydrofilních monomerů), 0,1 až 40$ hmot. ionogenních komonomerů, 0,1 až 45$ hmot. sítovadla, 0,05$ až 25$ hmot. polymerixovateIného haptenu, a popřípadě 0,05 až 7»5$ hmot. polymeriaovatelné fluorescenční značky, kde jednotlivé monomerní složky jsou definovány výše.

Monomerní roztok může navíc ještě obsahovat až 2$ hmot. polymerního aditiva s výhodou póly|jí-$Miydroxypropyl)methakrylamiduJ, Dále je možno použít póly(N-monosubstituovaný methakrylamid), poly(N-monosubstituovaný akrylamid), kde substituent může být alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku nebo hydroxyalkyl s 1 až 5 atomy uhlíku obsahující 1 až 2 OH skupiny, poly.(vin)dalkohol), po ly akry 1 amid, póly (ethylen) a póly(oxypropylen), jakož i monoalkylethery. Molekulová hmotnost aditiv je výhodně v rozmezí 5 000 až 250 000 daltonů. Po^werní adiV w tivum umožňuje ovlivnit rozměr částic. Rovněž umožňuje provádět ko* polymerigaci při vyšších koncentracích. Lze jej hodnotit jako stabilizátor částic.

Jako s vodou mísitelného rozpouštědla lze kromě Cj.-C^ alkoholů použít 1,4-dioxan, aceton, dimethylsulfoxid, dimethylformamid, ethyl241 262

-3.acetát atd.

I

Jako hydrofilních monomerů lze použít 2-hydroxyethylmethakrylát, 2-hydroxyethylakrylát, jakož i odpovídající monoestery <*· ,a*-dihydroxyoligo(oxyethylenu) a kyseliny methakrylové či kyseliny akrylové; 2,3-dihydroxypropylmethakrylát·, N-monosubstituovaný methakryl amid, N-monosubstituovaný akry1amid, N,N-disubstituovaný akrylamid, kde substituent může být alkyl s 1 až 5 atomy uhlíku nebo hydroxyalkyl s 1 až 6 atomy uhlíku, obsahující 1 až 2 OH skupiny, 4-vinylpyridin,) 2-vinylpyridin; akrylamid a methakrylamid. Je možno použít i C-označených monomerů.

Ionogenní komonomery jsou kyseliny methakrylové, kyselina akry lová, kyselina itakonová, maleinanhydrid, 2-(diethylamino)ethyl-me thakrylát, 2-(dimethylamino)ethyl-methakrylát, 2-(dimethylamino)ethyl-akrylát, 2-(diethylamino)ethyl-akrylát, p-diethylaminostyren, 2-methakryloyloxyethyltrimethylamoniumchlorid.

Jako sítovadla je výhodné použít N,N-methylenbis(akrylamid), N,N-ethylenbis(akrylamid), ],2,3-(triakryloyloxymethyl)propan, 1,3, 5-triakryloylhexahydrotriazin, ethylendimethakrylát, ethylendiakrylát, 2,2-oxydiethyldimethakrylát, jakož i dimethakryláty *.,«?-dihydroxyderiváty oligoetherů. Množství použitého sítovadla se řídí požadovaným stupněm sesítění. Je závislé na schopnosti daného síťovad la vytvářet příčné vazby.

Jako polymeri2ovatelné fluorescenční činidla lze použít například dansyljLLlylamin, N-fluorescein-N-allylthiomočovinu, N-tetramethylrhodamin-N-allylthiomočovinu a N-akridin-N-allylthiomočovinu.

Jako polymerixovatelné hapteny lze například použít N-methakry loylgJycylglycyl-N^-dinitrofenyllysin, N-methakryloylglycylglycylarsanilovou kyselinu, N-methakryloylglycylfenylalanyl-N^-dinitro- f 241 262 fenyllysin a N-methakryloylglycylleucyl-N -DNP-dinitrofenyllysin.

Při polymeri2.aci se postupuje tak, že směs monomerů (polymerisační směs) ae naplní do polymerizační nádobky, například skleněné ampule, probublá dusíkem nebo argonem asi 15-20 minut a zataví nebo jinak utěsní. Za teploty s výhodou 0«š4o°C se ampule umístí do centra kobaltového zdroje a ozáří tak, aby dávka byla OjlSiíMrad.

Po ozáření se ampule otevře, obsah lOx dekantuje nadbytkem destilované vody (event.směsí vody a s vodou mísitelného rozpouštědla a poté destilovanou vodou) a uschová při 4°C.

Vazbu protilátek je možno provést několika postupy. Například je možno využít interakce protilátek s haptenickými skupinami přítomnými ve struktuře, mikročástic (viz příklad l) nebo je možno využít funkčních skupin přítomných v ionogenních komonomerech - například -COOH skupin v molekule kyseliny methakrylové. K těmto skupinám je možno bioaktivní molekuly navázat pomocí N-cyklohexyl-N ^2-(4-morfolinyl)ethyljkarbodiimid - methyl p-toluensulfonátů, Woodwardova činidla, 2-ethoxy-l-ethoxykarbonyl-l,2-dihydrochinolinu a podobných, v peptidové chemii užívaných, kondenzačních činidel.

Mikročástice připravenépdle vynálezu jsou velmi vhodné pro použití k detekci specifických membránových znaků a k fagocytárním testům především buněk účastnících se na imunitních reakcích, ale i dalších typů buněk. Na rozdíl od řady dosud používaných technik je možno současně detekovat jak vazbu částice na sledovaný receptor, tak i fagocytózu tímto receptorem zprostředkovanou. Zvlášt výhodné se jeví být použití částic se zapolymerovanou fluorescenční značkou, umožňující při detekci ve fluorescentním mikroskopu rozlišení fagocytované od nefagocytované částice použitím vhodné látky zhášející fluorescenci nefagocytovaných částic. Odlišení fagocytovaných od nefagocytovaných mikročástic se provede po proběhnutí testu zhasnutím fluorescence fluorescentní modifikace mikročástic zhášecí látkou, například krystalovou violetí.

Výhodou zabudování haptenů přesně definované struktury postupem dle vynálezu je to, že hapteny nejsou z mikročástic uvolňovány do prostředí a zachovávají si svoji imunogennost i funkceschopnost. Vazba bioaktivních molekul přímou polymeriXfecí, ale i prostřednictvím konden«ačních činidel je velmi jednoduchá a stálá. Trvanlivost suspenze samotné i s navázanými hapteny byla ověřována na Imunolo- r241 282 gickém oddělení MBÚ ČSAV od dubna 1981 do února 1984.

V dalším jsou uvedeny příklady objasňující předmět vynálezu, aniž by jej nějak omezovaly.

Příklad 1

Reakcí 5 tetramethylrhodamtn i sothiokyanátu s nadbytkem allylaminu v acetonu při 50°C byla připravena N-tetramethylrhodamin-N*-allylthiomočovina. Aceton a nadbytečný allylamin byly oddestilovány za sníženého tlaku. K získanému oleji bylo přidáno 0,4 ml směsi monomerů (76,9 hmot.dílů 2-hydroxyethylmethakrylátu, 0,1 hmot.dílů ethylendimethakrylátu, 2 hmot.díly methylen-bis-akrylamidu, 20 hmot. dílů methakrylové kyseliny a 1 hmot.díl N-methakryloylglycylglycyl-N^-dinitrofenyllysinu) a 19,6 ml destilované vody. Získaný homogenní roztok byl přefiltrován, naplněn do ampule, probublán 15 min. dusíkem a ozářen v ^°Co zdroji (l,2 Mrad). Získaná suspenze byla nalita do přebytku destilované vody, 7* děkantována. Byla získána suspen ze částic o velikosti 2pm.

Tyto částice byly reagovány s maximální subaglutinační dávkou myších monoklonálních anti-trinitrofenyl protilátek, isotyp IgE. Částice byly promyty (600g, 10 min.), resuspendovány a uchovávány při 4°C. Byly používány k detekci receptorů pro imunoglobuliny na povrchu buněk a k fagocytárním testům.

Příklad 2 lOg směsi sestávající z 77» 8$ hmot. 2-hydroxyethylmethakrylátu, 2$ hmot .methylen-bis-akrylamidu, 0,2$ hmot .polyethylenoxidmonomethyletheru o = 5 000 a 20$ hmot.kyseliny methakrylové bylo rozpuštěno ve 190 ml destilované vody. Dále bylo při polymerizaci postupováno jako v příkladu 1. Byly získány částice o průměru l,2^*m 50 p»g mikročástic (suchá hmotnost) bylo resuspRndováno v 1 ml roztoku čištěné C 3 složky komplementu (l mg/ml). Po vychlazeni na

- 6 241 262

4°C bylo pomalu za intenzivního třepání přidáno 5 mg N-cyklohexyl-N^z-£2-(4-morfolinyl)ethylJkarbodiimid methyl p-toluensulfonátu. pH bylo ihned upraveno na 7»0 a mikročástice byly inkubovány 10 hodin při 4°C zb stálého třepání. Po několikerém promytí ve fyziologickém roztoku (250 g, 15 minut) a naředění na koncentraci 10 částic/ml bylo 0,1 ml takto zředěných mikročástic smícháno s 10^ buněk (v 0,1 ml) a inkubováno 60 min. při laboratorní teplotě. Buňky s adherovanými 3 a více mikročásticemi byly považovány za buňky nesoucí receptor pro C 3 složku komplementu.

Příklad 3 mg dansyallylaminu bylo rozpuštěno v 4,5 ml směsi monomerů, sestávající z 50% hmot. 2-hydroxyethylmethakrylátu, 20% hmot. N,N-diethylakry1amidu, 4% hmot.triethylenglykoldimethakrylátu a 26% hmot.kyseliny akrylové. K tomuto roztoku bylo přidáno 245 ml destilované vody. Dále bylo při polymerixaci postupováno stejně jako v příkladu 1.

Příklad 4

Reakcí 3 mg fluoresceinisothiokyanátu (isomer i) s nadbytkem allylaminu v acetonu při 40°C byla připravena N-fluorescein-N*-allylthiomočovina. Aceton a nadbytečný allylamin byly oddestilovány za sníženého tlaku. K získaným krystalkům bylo přidáno 0,6 ml směsi monomerů (77 hmot.dílů 2-hydroxyethylmethakrylátu, 2 hmot.díly methylen-bis-akrylamidu, 20 hmot.dílů kyseliny methakrylové a 1 hmot.díl N-methakryloylglycylglycyl-N^-dinitrofenyllysinu) a 15,4 ml destilované vody. Dále bylo při polymerizaci postupováno stejně jako v příkladu 1. Tyto částice byly inkubovány s maximální subaglutinační dávkou myších monoklonálních anti-trinitrofenyl protilátek isotypu IgM (22°C, 1 hod). Pot«*»byly částice promyty, resuspendovány a skladovány v lednici. Byly použity k detekci Fc receptorů na povrchu buněk - po inkubaci buněk s takto modifikovanými mikročásticemi (22°C) byly buňky pozorovány ve fluorescenčním mikroskopu. Buňky, které měly adherovány 3 a více mikročástic, byly považovány za buňky obsahující Fc receptory.

241 282

- ?Příklad 5

Byly připraveny dva zásobní roztoky. Roztok A, sestávající z 0,03 g N,N-methylenbis(akrylamidu), 1,309 g 2-hydroxyethyl-methakrylátu a 0,308 g 2-(diethylamino)ethyl-methakrylátu. Roztok B, ses távající z 1,589 g polyethylenoxidmethyletheru (m. v. 5 OOO), rozpuštěného v 38,2 ml vody. Do skleněné ampule bylo předloženo 0,4 ml roztoku A, 4 ml roztoku B a 35,é ml .vody. Dále bylo při polymerixaci postupováno jako v příkladu 1.

Příklad 6 < , mg dansylallylaminu bylo rozpuštěno ve směsi monomerů, sestávající z 55% hmot. 2-liydroxyethy 1-methakrylátu, 15% hmot. N-ethyl akrylamidu, 5% hmot. 1,2,3-(triakryloyloxymethyl)propanu a 25% hmot 4-vinylpyridinu. K tomuto roztoku bylo přidáno 230 ml destilované vody. Dále bylo při polymerixaci postupováno stejně jako v příkladu 1.

Claims (6)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Polymerní mikročástice na bázi hydrofilních monomerů llrsdlllljTcT specifické skupiny, usnadňující jejich detekci a umožňi|jíc^ bu protilátek, vyznačené tím, že sestávají z 25 až 99»í|% hydrofilních monomerů vybraných ze skupiny sestávajíce z 2-hydroxyethylmethakrylátu, 2-hydroxyethylakrylátu, jakož i odpovídajících monoesterů *,u'-dj.hydroxyoligo(oxyethylenu) a kybéTiny methakrylové či kyseliny akrylové, 2,3-dihydr oxy pr opyl-methakry láftji, N-monosubstituovaného methakrylamidu, N-monosubstituovaného akrylamidu, N,N-disubstituovaného akrylamidu, kde substituent může být alkyl s 1 až 5 atomy uhlíku nebo hydroxyalkyl s 1 až 6 atomy uhlíku, obsahující 3 až 2 OH skupiny, 4-vinylpyridinu, 2-vinylpyridinu, akrylamidu a methakrylamidu, 0,1 až 40% hmot. ionogenních komonomerů vybraných ze skupiny sestávající z kyseliny methakry lové, kyseliny akrylové, kyseliny itakonové, maleinanhydridu,
2. 2-(die thy lamino) ethyl-methakry látu, 2-(dime thy lamino) ethyl -methakry látu, 2-(dimethylamino)ethyl-akrylátu, 2-(diethylamino)ethyl-akrylátu, p-diethylaminostyrenu a 2-methakryloyloxyethyltrimethylamoniu.nic hloridu, 0,1 až 45% hmot. sítovadla vybraného ze skupiny sestávající z Ν,Ν-methylenbis(akrylamidu), N,N-ethylenbis(akrylamidu), 1,2,3-tri(akryloyloxymethyl)propanu, 1,3,5-triakry1oylhexahydrotriazinu, ethylendimethakrylátu, ethylendiakrylátu,

   2,2-oxydiethyl-dimethakry látu, dimethakrylátu * ,tu-dihydroxyderivátů oligoetherů a 0,05 až 25% hmot. kovalentní vazbou vázaného haptenu vybraného ze skupiny sestávající z N-methakryloylglycylglycyl-N^-dinitrofenyllysinu a N-methakryloylglycylfenylalanyl-N^ť -dinitrofenyl1ysinu a N-methakryloylglycylleucyl-N^-dinitrofenyllysinu a popřípadě 0,05 až 7»5% hmot. polymerizpvatelné fluorescenční značky vybrané ze skupiny sestávající z dansylallylaminu, N-fluorescein-N-allylthiomočoviny a N-tetraměthylrhodamin-N-allylthiomočoviny.

   2. Polymerní mikročástice podle bodu 2j vyznačené tím, že hydrofilní monomer je 2-hydroxyethylmethakrylát.

   -1241 282
3. 3. Polymerní mikročástice podle bodu 1, vyznačené tím, že ionogenní komonomér je kyselina methakrylová.
4. 4. Polymerní mikročástice podle bodu J, vyznačené tím, že sítovadlo je N,N-meth>tJenbis(akrylamid) .
5. 5. Způsob výroby mikročástic na bázi hydrofilních monomerů, obsahuj íte Specifické skupiny usnadňující jejich detekci Ά umožňující uclakem radikála vzniklých ozářením/ vazbu protilátek podle bodu vyznačený tím, Ze séyiTbpdTýlnerÁauje roztok složený z 1 až 10# hmot. směsi monomerů a 9θ až 99# hmotvody nebo její směsi s 0 až 20# obj . . alkoholů nebo jintite s vodou mísitelného rozpouštědla, přičemž monomerní směs je složena z 25 až 99»5# hmot. nydrofilního monomeru (hydrofilních monomerů), 0,1 až 40#>hmot. ionogenních komonomerů, 0,1 až 45# hmot. síťovadla, 0,05# až 25# hmot. polymeriiovatelného haptenu a popřípadě 0,05 až 7>5# hmot. polymerizovatelné fluorescenční značky, kde jednotlivé monomerní složky jsou definovány v bodu 1.
6. 6. Způsob podle bodu 5, vyznačený tím, že monomerní roztok obsahuje navíc až 2# hmot. polymerního aditiva, s výhodou póly [~N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidjtv.