CS240462B1 - Sposob stanovenia aktivity endo-l,4-/?-glukanáz - Google Patents

Description

240462

Vynález sa týká spósobu stanovenia ak-tivity endo-l,4-jS-glukanáz (EC 3.2.1.4). Běžné sposoby stanovenia aktivity endo--l,4-p’-glukanáz ako základných zložiek ce-lulolytických enzýmových. systémov sú za-ložené na kvantitatívnom stanovení redu-kuj Ocích sacharidov· uvolněných z neroz-pusínej celulózy alebo z jej rozpustných de-rivátov. Tieto metody nie sú však selektiv-ně, pretože na tvorbě redukujúcich sacha-ridov sa podielajú .aj iné zlcžky celulolytíc-kých enzýmových systémov ako sú napr.exo-^-glukanázy alebo β-glukózidázy (ce-lobiázy). Nedajú sa použit na sledovanie ak-tivity endo-l,4-$-glukanáz v roztokoch ob-sahujúcich vyššie hladiny redukujúcich lá-tok, hlavně cukro-v a tak isto neumožňujústanovenie aktivity uvedených glukanáz via-zaných na živé buňky, připadne v přítom-nosti buniek, ak tieto využívajú uvolněnénízkomolekulové fragmenty substrátu akozdroj uhlíka.

Viskózimetrickú metodu stanovenia akti-vity endo-l,4’/3-glukanáz využitím rozpust-ných derivátov celulózy možno označit zavelmi citlivú a špecifickú metodu stanove-nia aktivity endo-1,4-/3-glukanáz, ktorá všakvzhladom na časová náročnost nie je vhod-ná na analýzu váčšieho počtu vzoriek. Inýmprincipům stanovenia aktivity endo-1,4-/3--glukanáz je meranie množstva farbiva u-volneného do roztoku vo formo rozpust-ných fragmentov z celulózy s kovalentneviazaným farbivom. S výnimkou jedného pří-padu [B. V. McCleary: Carbohydr. Res. 86,97 (1980)] všetky doteraz navrhnuté chro-mogénne substráty na stanovenie aktivityendo-1,4-/3-glukanáz sú vo vodě nerozpust-né. Jedná sa o modré deriváty mikrokryš-talickej celulózy [M. Linko, M. Leisola: Anal.Biochem .70, 592 (1976)], celulózy s čias-točne zníženým stupňom kryštalinity (Cal-biochem AG 1980, katalogové č. 219 481)alebo nerozpustnej sieťovaňe] hydroxyetyl-celulózy (čs. AO 192 202).

Použitie nerozpustných substrátov je spo-jené s ťažkosťami ich přesného dávkovaniaa potřebou miešania inkubačných zmesí, načo upozorňujú výsledky finských autorov[M. Leisola, M. Linko: Biochemical Labora-tory Report 13, Technical Research Centreof Finland, Helsinky .(1976)]. Nerozpustnéchromogénne substráty nie sú vhodné nastanovenie enzýmov viazaných na povrchbuniek alebo na rožne buňkové membrány.Vytváranie enzým-substrátového komplexuv celom objeme zmesí umožňujú substrátyvo vodě rozpustné. Takýto chromogénnysubstrát na stanovenie aktivity endo-1,4-/3--glukanáz bol připravený na báze karboxy-metylcelulezy, ktorá sa však před vlastnýmviazaním farbiva musela ešte parciálně hyd-rolyzovať celulázami (Austrálsky patent48 831/79],

Stanovenie aktivity na rozpustný chro-mogénny substrát spočívá v meraní rych-losti uvoiňovania farbených fragmentov roz- pustných po přidaní organického' rozpúš-ťadla, ktoré kvantitativné zráža východzípolymérny substrát a jeho vysokomoleku-lárne podřely po čiastočnej enzýmovej de-gradácii. Keďže stanovenie je založené nadepolyraerizácii substrátu vedúcom k tvor-bě farebných fragmentov rozpustných v pří-tomnosti organických rozpúšťadiel, přes-nost stanovenia významné ovplyvňuje ió-nová sila prostredia [B. V. McCleary: Car-bohydr. Res. 86, 97 (1976)]. Podobné sub-strátové vlastnosti má i chromogénny sub-strát na stanovenie aktivity endo-1,4-0-glu-kanáz připravený auíormi tohto vynálezu —trojsodná sol 4-(N-etyl-N-fenylamíno)-6-- [ 4-metyl-,2-sulf obenzén-l-azo-2- (1-hydroxy--3,6-bissulf onaft-l-yl) amí no ] -1,3,5-triazin--2-yl-hydroxyetylcelulózy.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že hyd-roxyetylcelulóza obsahujúca 2,5 až 20 %hmot. kovalentne viazaného červeného far-biva trojsodnej soli 2-chlór-4-(N-etyl-N-fe-nylamíno)-6-[4-metyl-2-sulfobenzén-l-azo--2 - (1-hydr oxy-3,6-biiSsulf onaft-l-yl) amíno ] --1,3,5-triazínu sa rozpustí v pufri 0' pH 4,0až 6,0 v koncentrácii 0,1 až 1,5 % hmot.za intenzívnebo miešania pri teplote 20 až30 °C a získaný roztok sa použije ako sub-strát do zmesí s roztokem alebo suspenziouna partikuly viazaných endo-1,4-/3-glukanáz,v kterých sa enzýmová reakcia prebiehajú-ca pri teplote 20 až 50 °C po dobu 5 až180 min. zastavuje přidáním dvoch až šty-roch objemov zmesí etylalkohol aceton 1:: 1 až 4:1 obj. obsahujúcej 0 až 0,1 mol.. i-1 octan sodný, čím sa vyzráža podřel ne-hydrolyzovaného substrátu, ktorý sa po cen-trifugách oddělí od rozpustných farebnýchfragmentov uvolněných účinkom enzýmu aktorých množstvo je úměrné koncentráciienzýmu v, zmesi, ako i trvaniu inkubácie,a ktoré sa stáno via spektr ofotometricky pri550 nm. Výhodou navrhovaného spňsobu stanove-nia aktivity endo-1,4-,5-glukanáz je, že vy-užívá chromogénny substrát rozpustný vovodě a v pufrocb, resp. v koncentrovaněj-ších pufroch z malej časti homogénne dis-pergovaný, čo zaručuje rovnoměrné rozlo-ženie substrátu v enzymových inkubačnýchzmesiach a odstraňuje požiadavky na mře-šanie, a že enzýmová reakcia sa zastavu-je jednoducho přidáním organického' roz-půšfadla, čo vedie k vyzrážaniu substrátus výnimkou nízkomolekulárnych farebnýchfragmentov uvolněných účinkom enzýmu zpovodně zrážateíného substrátu. Ďalšou vý-hodou je, že spósob stanovenia aktivity jespecifický pre endo-1,4-/3-glukanázy, že jevýnimečne citlivý, že nie je ovplyvnený prí-íomnosťou exo-/3-glukanáz a /3-glukózidáz,že umožňuje stanovit aktivitu endo-1,4-jS--glukanáz aj v přítomnosti redukujúcich lá-tok, napr. sacharidov, ak tieto nemajú in-hibičný účinok na enzými, že je vhodný preanalýzu enzýmu v přítomnosti živých bu- 240462 niek, ako i enzymu viazaného na buňkovéštruktúry, a že je výnimočne vhodný naanalýzu velkého počtu v-zoriek získanýchpo frakcionácii bielkovín chromatografiou,chromatofokusáciou, elekíroíorszou a e-lektrofokusáciou. P r í k 1 a d 1 80 mg hydroxyetylcelul-ázy obsahujúcej10 % hmot. trojsodnej soli 4-(N-etyI-Ň-íe-nylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén -1-azo--2- (1-hydr oxy-2,6-bissulf onaf t-l-yl j amíno ] --l,3,5-triazin-2-yl (Ostazin bril. červeň H——3B) sa rozpustí za stálého m-iešania v 10mililitrech cítrát-fosfátovéfoo pufru zlože-nia: 1 diel 0,1 mol. i-1 kyseliny citrónoveja 1 diel 0,2 mol. i-1 hydrogénfosforečnanudisodného a 2 diely vody, o pM 4,8. 0,5 mlalikvóty tolito roztoku vyhriateho na 30 °Csa miešajú s 5 až 50 μ\ neriedeného, desať-krát a paťdesiatkrát riedeného roztoku ce-lulóz, resp. endo-l,4-jS-glukanáz a zmesi sainkubujú při teplote 30 °C po dobu 10 min.Reakcia sa zastaví přidáním troch objemovzmesi 96 % etylalkohol — aceton 2 : 1 obj.(1,5 ml), čím sa vyzráža vysokomolekulár-ny podiel substrátu, kým nízkomolekulárnefragmenty uvolněné účinkem enzýmu -ostá-vajú po přidaní organického zrážadla. v roz-toku. Po 10 min. stání pri teplote 22 °C sazmesi opat premiešajú a centrifugujú 1min. pri 2 000 g.

Absorbancia čirých supernatantov sa me-ria. pri 550 nm oproti vzorke neobsahujú-cej roztok enzýmu. Farebná intenzita super-natantov je v určitom rozmedzí úměrnámnožstvu enzýmu v inkubačnej zmesi akoa] trvaniu inkubácie. Citlivostí stanoveniaje daná teplotou zrážanis nehydrolyzované-hO' substrátu ako aj iónovou silou roztoku.Za jednotku aktivity endo-l,4-|3-glukanázysa považuje množstvo. farebných fragmen-tov rozpuštěných v zmesi citrát-fosfátovýpufer — etylalkohol — aceton 1:2:1 obj.,v kíorých sa nachádza 1 % hmot. z celko-vého množstva farbiva viazaného v sub-stráte přitomnom v inkubačnej zmesi. Pře-vod hodnot absorbancie pri 550 nm na ku-taly alebo medzinárodné jednotky aktivityje možný po stanovení množstva redukujú-cich sacharidov uvonených za rovnakýchpodmienok z ekvivalentného množstva ne-farebnej hydroxyetylcelulózy. P r í k 1 a d 2

Hydroxyetylcelulóza obsahujúca 15 %hmot. kovalentne viazanej trojsodnej soli4 (N-etyl-N-f enylamíno j -6- [ 4-metyl-2-sulfo-benzén-l-azo-2- (1-hydr oxy-3,6-bissulf onaf í--l-ylj-amínoJ-l,3,5-triazín-2-yl- sa za mieša-nia pri teplote 25. °C rozpustí v 0,1 mol.. r1 acetátovom pufri o pH 5,0 a zloženia7dielov 0,1 mol. I-1 octanu sodného a 3 die-ly 0,1 mol.r1 kyseliny octovej, aby kon-centrácio substrátu bola 16 mg/ml. Za tých- to podmienok ostává nepatrná část substrá-tu nerozpuštěná, avšak homogenně disper-govaná vo formo jemnej zrazeni-ny. 0,25 mltohto roztoku substrátu vyhriateho na tep-lotu 30 '“C sa mieša s 0,25 ml vhodné riede-ného roztoku enzýmu a inkubuje sa pri tep-lete 30 CC. E-nzýmová reakcia sa zastavujea vyhodnocuje ako v příklade 1, berie savšak do úvahy vyšší obsah farbiva viazané-ho na hydroxyetylcelulózu. P r í k I a d 3

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým roz-dielom, žs sa použije hydroxyetylcelulózaobsahujúca' 2,5 % hmot. kovalentne viaza-ného farbiva, že enzýmová reakcia sa usku-tečňuje pri teplote 50 °C a zastavuje sa při-dáním štyroch objemov zmesi etylalkoholaceton 4 : 1 obj. Příklad 4

Pri zvýšených požiadavkach na přesnoststanovenia aktivity endo-l,4-/3-glukanáz po-dlá příkladu 1 až 3 sa meria pře každávzorku analyzovanú časová závislost uvol’-ňovania farebných fragmentov substrátu. Zgrafických závislostí absorbancie pri $50nm trvania enzýmovej reakcie sa určia směr-nice závislosti pre počiatočný čas reakcie,ktoré sú priamoúmerné koncentrácii enzý-mu v inkubačnej zmesi, teda i jeho aktivi-tě. Příklad 5

Sposob stanovenia aktivity endo-l,4-i/S-glu-kanáz na farebnú hydroxyetylcelulózu po-dat príkladov 1 až 4 poskytuje reproduko-vatefné výsledky, ak sa vo všetkých přípa-dech zachovóvajú parametre, ktoré ovplyv-ňujú rozpustnost farebných fragmentov. u-votnených účinkom enzýmu v zmesi po při-daní organického zrážadla, a íc teplota zrá-žania a centriřugácie a iónová sila zráža-cej zmesi, Vplyv menších zmien koncentrá-cií solí sa dá eliminovat přidáním interné-ho elektrolytu, napr. 0,2 mol.l-1 chloridusodného do roztoku substrátu. Zvýšenie ió-novej sily znižuje rozpustnost farebnýchfragmentov hydroxyetylcelulózy v přítom-nosti organického zrážadla, čo má za ná-sledek celkové zníženie citlivosti stanove-nia. Příklade

Vplyv meniacej sa koncentrácie solí vroztoku enzýmu na reprodukovateínosť sta-novenia aktivity endo-l,4-,3-glukanáz, akoje uvedené v příklade 5, sa odstráni ^přidá-ním interného elektrolytu do zrážacej zme-si. Enzýmové reakcie uskutečňované podlápříkladu 1 až 4 sa zastavujú přidáním trochobjemov zmesi etylalkohol — aceton 2 : lobj., obsahujúcej 0,1 mol . I-1 octan sodný.

Claims (1)

1. 240162 Vynález má použitie v biochemii, moleku-lárně] biologii a moderných biotechnoló- 8 giach pri charakterizácii, identifikácii a sta-novení aktivit endo-l,4-tj3-glukanáz. PREDMET Sposob stanovenia aktivity endo-l,4-/J-glu-kanáz vyznačený tým, že hydroxyetylcelu-lóza obsahujúca 2,5 až 20 °/o hmot. kova-lentne viazaného červeného farbiva, troj-sodnsj soli 2-chlór-4(N-etyl-N-fenylamínoj--6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (1-hydro-xy-3,6-bissulf onaft-l-yl ] amíno ] -1,3,5-triazí-nu sa rozpustí v koncentrácii 0,1 až 1,5pere. hmot. pri teplote 20 až 30 °C vo vo-dě alebo v pufri o pH 4 až 6 a inkubuje sav objeme 0,5 až 2,0 ml s roztokom endo--l,4-/3-glukanáz pri teplote 20 až 50 °C po VYNALEZU dobu 5 až 180 min, kedy sa enzýmovd reak-cia zastaví přidáním dvoch až štyroch ob-jemov zmesi etylalkohol — aceton 1 : 1 až4:1 obj. obsahujúce] 0 až 0,1 mol. I"1 oc-tan sodný, čím sa vyzráža vysokomoleku-lárny podiel substrátu, ktorý sa centrifugá-ciou oddělí od rozpustných farebných frag-mentov uvolněných účinkom enzýmu, kto-rých množstvo je úměrné koncentrácii en-zýmu v reakčnej zmesi a trvaniu inkubá-cie, a ktoré sa stanovia spektrofotometric-ky pri 550 nm. Severografia, n. p., závod 7, Most Cena 2,40 Kčs