CS238794B1

CS238794B1 - Inactivated rabies tissue vaccine and method for its preparation

Info

Publication number: CS238794B1
Application number: CS84219A
Authority: CS
Inventors: Vladimir Vrzal; Josef Chumela; Libor Zatloukal
Original assignee: Vladimir Vrzal; Josef Chumela; Libor Zatloukal
Priority date: 1984-01-10
Filing date: 1984-01-10
Publication date: 1985-12-16
Also published as: CS21984A1

Abstract

Inaktivovaná tkáňová.vakcina proti vzteklině je určená k imunoprofylaxi vztekliny u psi, koček, Skotu, koní, ovcí a ostatních hospodářských a domácích zvířat. Obsahuje inakrivováný virus vztekliny kmene Vnukovo - 32/CAMP V - 286/ v lyofilizovanám stavu. Vakcina es k použití připraví rozpuštěním v lipoidním adjuranse. Inaktivovaná vakcina proti vzteklině so vyrábí pomnožgním kmene viru vztekliny Znukovo-32 na buneěných liniích křsSčlch Ledvin v růstovém minimálním esenciálním sédiu s přídavkem bovinnlho séra po dobu í až 8 dnů při teplotě 32 C až do dosažení ainimálního titru MIC U)jq 10*./0,03 cm3, ayě 8 až 10 g i. c./ a potom as virus Lnaktivujs účinkem beta - propiolaktonu nebo radiačním ozářením Co θβ lyofilizujese.Inactivated tissue vaccine against rabies is intended for immunoprophylaxis of rabies in dogs, cats, cattle, horses, sheep and other farm and domestic animals. It contains inactivated rabies virus strain Vnukovo - 32 / CAMP V - 286 / in a lyophilized state. The vaccine is prepared for use by dissolving in a lipoid adjuvant. Inactivated rabies vaccine is produced by multiplying the Znukovo-32 rabies virus strain on rat kidney cell lines in growth minimal essential medium with the addition of bovine serum for 1 to 8 days at a temperature of 32°C until a minimum titer of MIC (10*/0.03 cm3, or 8 to 10 g i. c.) is reached, and then the virus is inactivated by the action of beta-propiolactone or by radiation irradiation and lyophilized.

Description

Vynález se týká inaktivované tkáňová vakcíny proti vzteklině a způsobu její přípravy.The invention relates to an inactivated tissue vaccine against rabies and a method for its preparation.

Vzteklina patří mezi nejstarěí známá nemoci. Pocit děsu, který tato nemoc vyvolává, spolu s výraznými charakteristickými klinickými příznaky, které ji tak často doprovázejí, byly příSinou, že je,.její výskyt v celé historii poměrně dobře doložen. V současné době je v celém světě prudký vzestup výskytu vztekliny a mezinárodní úsilí pochopit tuto nemoc a kontrolovat ji, dosahuje nebývalých rozměrů. Očkování je jedinou spolehlivou ochranou proti vzteklině jak pro člověka, tak i pro domácí a hospodářská zvířata.Rabies is one of the oldest known diseases. The sense of terror that this disease evokes, together with the distinctive clinical signs that so often accompany it, have led to its occurrence being relatively well documented throughout history. Currently, there is a sharp increase in the incidence of rabies worldwide, and international efforts to understand and control the disease are reaching unprecedented proportions. Vaccination is the only reliable protection against rabies for both humans and domestic and farm animals.

V roce 1921 bylo Japonsko prvou zemí, které masově imunizovala psý proti vzteklině. Vakclna, která byla k tomuto účelu použita, byla připravena z nervová tkáně a vakcíny to tohoto typu se stále v rozsáhlé míře používají ve veterinární medicíně. Pro zvířata se v mnoha zemích používají vakcíny obsahující živý vakcinační virus vztekliny. Dvě nejznáměj ěí (označované jako FLURY - LEP a FLURY - HEP) se připravují z infikovaných kuřecích embryí a jsou používány k vakcinaci v 40 až 50 pasáží (LEP) a ve 180 pasáži nebo i výšší (HEP). Obě vakcíny ee vyrábějí v mnoha zemích a stále se jich používá. Později byly vyvinuty vakcíny z viru vztekliny pomnoženého na tkáňových kulturách.In 1921, Japan was the first country to mass-immunize dogs against rabies. The vaccine used for this purpose was prepared from nerve tissue, and vaccines of this type are still widely used in veterinary medicine. Vaccines containing live rabies vaccine virus are used for animals in many countries. The two best known (designated FLURY-LEP and FLURY-HEP) are prepared from infected chicken embryos and are used for vaccination at 40 to 50 passages (LEP) and at 180 passages or higher (HEP). Both vaccines are produced in many countries and are still used. Later, vaccines based on rabies virus propagated in tissue cultures were developed.

Nejznámější kmeny viru vztekliny adaptovaná na tkéňová kultury jsou kmen Vnukovo-32 a Kmen ERA. Oba pocházejí z téhož kmene viru vztekliny (SAD). Vakclna vyrobená z prvního kmene se převážně vyrábí v SSSR a zemích RVHP, druhé vakcína, vyvinutá v Kanadě, se používá v Severní a Jižní Americe, v zemích západní Evropy a v Jižní Africe.The most well-known strains of rabies virus adapted to tissue culture are the Vnukovo-32 strain and the ERA strain. Both originate from the same rabies virus strain (SAD). The vaccine made from the first strain is mainly produced in the USSR and the countries of the Common Market for Economic Cooperation and Development, while the second vaccine, developed in Canada, is used in North and South America, Western Europe, and South Africa.

Nejlepělch výsledků, jak v účinnosti, tak bezpečnosti, je v poslední době dosahováno a antirabickou vakcínou připravenou na lidských diploidních buňkách. Produkce této vakcíny věak je obtížná a drahé a používá se pouze k imunizaci lidí.The best results, both in terms of efficacy and safety, have recently been achieved with a rabies vaccine prepared in human diploid cells. However, production of this vaccine is difficult and expensive and it is used only for human immunization.

Vedle vakcín, obsahujících živý vakcinační virus vztekliny, je současný světový trend vyvíjet a vyrábět inaktivované tkáňové antirabické vakcíny i pro veterinární použiti. Tyto vakcíny mohou být pak sdružovány v plyvalentní vakcíny, ale hlavni důvod používání inaktivovaných antirabických vakcín spočívá v jejich bezpečnosti.In addition to vaccines containing live rabies vaccine virus, the current global trend is to develop and produce inactivated tissue rabies vaccines for veterinary use. These vaccines can then be combined into polyvalent vaccines, but the main reason for using inactivated rabies vaccines lies in their safety.

V budoucnu bý ideální vakcíny proti vzteklině měly být připravovány z izolovaného G proteinu viru vztekliny. Tento cil se však jeví dosud málo reálný, nepřesahující rámec laboratoří základního výzkumu.In the future, ideal rabies vaccines would be prepared from the isolated G protein of the rabies virus. However, this goal still seems unrealistic, not going beyond the scope of basic research laboratories.

V současné době je v CSSR imunoprofylaxe proti vzteklině u hospodářských a domácích zvířat zajišťována třemi druhy vakcín.Currently, immunoprophylaxis against rabies in farm and domestic animals is provided in the CSSR with three types of vaccines.

1. Vakcína proti vzteklině1. Rabies vaccine

2. Vakclna proti vzteklině avianizované2. Avianized rabies vaccine

3. Vakcína proti vzteklině tkáňové3. Tissue-borne rabies vaccine

Charakteristika těchto vakcín:Characteristics of these vaccines:

ad 1, Vakcína proti vzteklině byla prvním antirabickým preparátem vyráběným na našem území pro imunizaci zvířat. Metoda výroby byla převzata v roce 1947 i s infekčním virem vztekliny kmene fix GNKI ze Sovětského svazu. K imunoprofylaxi vztekliny se používala na našem území výlučně až do roku 1965, a sehrála tak svou kladnou roli v tomto období k prevenci vztekliny u domácích a hospodářských zvířat. U vakcíny proti vzteklině jde o orgánovou vakcínu, kde virus vztekliny je pomnožen v mozku ovcí. Tento substrát obsahuje mimo viru i další bílkoviné komponenty, které mohou způsobit různé postvakcinační reakce. Vlastní způsob výroby je zastaralý a technologicky problematický.ad 1, The rabies vaccine was the first anti-rabies preparation produced in our country for animal immunization. The production method was adopted in 1947, including the infectious rabies virus of the GNKI strain fix from the Soviet Union. It was used in our country exclusively for rabies immunoprophylaxis until 1965, and thus played a positive role in this period in preventing rabies in domestic and farm animals. The rabies vaccine is an organ vaccine, where the rabies virus is multiplied in the brain of sheep. This substrate contains, in addition to the virus, other protein components that can cause various post-vaccination reactions. The actual production method is outdated and technologically problematic.

ad 2. Vakcína proti vzteklině avianizovaná se používá v ČSSR od roku 1965. Její používání přispělo podstatným dílem k poklesu výskytu vztekliny u psil. Jde o živou vakcínu obsahující oslabený virus vztekliny kmene Flury - LEP, který ee pro výrobu vakciny pomnožuje v kuřecích embryích. Rovněž tato vakcína obsahuje nežádoucí balastní komponenty. Nevýhodou vakciny je, že je použitelná pouze u psů starších tří měsíců a není použitelná pro ostatní druhy hospodářských a domácích zvířat, jelikož může v některých případech vyvolat u těchto zvířat onemocnění vzteklinou (R. Procházka, J. Chumele: Výsledky ověřování vakcinacě mladého skotu vakcínou proti vzteklině Flury - LEP. Imunoprofylaxia,ad 2. The avianized rabies vaccine has been used in the Czechoslovak Socialist Republic since 1965. Its use has contributed significantly to the decrease in the incidence of rabies in dogs. It is a live vaccine containing a weakened rabies virus of the Flury - LEP strain, which is multiplied in chicken embryos for the production of the vaccine. This vaccine also contains undesirable ballast components. The disadvantage of the vaccine is that it is only applicable to dogs older than three months and is not applicable to other types of farm and domestic animals, as it can in some cases cause rabies in these animals (R. Procházka, J. Chumele: Results of verification of vaccination of young cattle with the Flury - LEP rabies vaccine. Immunoprophylaxis,

80, 1 , 2, 29 až 34).80, 1, 2, 29 to 34).

ad 3. Vakcína proti vzteklině .tkáňová obsahuje živý modifikovaný vakcinační kmen viru vztekliny VNUKOVO - SAS - 32, pomnožený na tkáňových kulturách buněčná linie BHK 21. Výhodou tohoto typu vakciny je nepřítomnost balastních látek typu myelinu, které jsou u jiných vakcín často příčinou postvakcinačnlch komplikací. Vzhledem k tomu, že tato vakcína nezatěžuje organismus balastními látkami, vytvářejí se příznivějěi podmínky pro vytvoření solidní imunity. Tento druh vakciny proti vzteklině je možno použít pro imunizaci všech druhů hospodářských a domácích zvířat. Nevýhodou této vakciny je (jako u všech živých antirabických vakcín), riziko možnosti změny vlastností živého vakcinačního kmene, a tím ohrožení vakcinovaných zvířat a táž i člověka.ad 3. Rabies vaccine. tissue contains a live modified vaccine strain of rabies virus VNUKOVO - SAS - 32, propagated in tissue cultures of the BHK 21 cell line. The advantage of this type of vaccine is the absence of ballast substances of the myelin type, which are often the cause of post-vaccination complications in other vaccines. Since this vaccine does not burden the organism with ballast substances, more favorable conditions are created for the formation of solid immunity. This type of rabies vaccine can be used for immunization of all types of farm and domestic animals. The disadvantage of this vaccine is (as with all live anti-rabies vaccines), the risk of possible changes in the properties of the live vaccine strain, thereby endangering vaccinated animals and humans.

Vakcinacě proti vzteklině je nejdůležitějšl a nejefektivnějěí zbraní proti této nákaze. V minulosti i současnosti mnoho vyspělých pracoviší se zabývalo vývojem nových dokonalejších druhů antirabických vakcín. Současný světový trend ve výrobě vakciny proti vzteklině pro veterinární i humánní použiti se ubírá cestou kultivace vitu na tkáňových kulturách s případnou purifikací a inaktivacl viru (J. P. Soulebot at al.;: Medical prophylaxis of animal rabies: choice of an inactivated Vaccine. Ann. Virol (Inst Pasteur)Rabies vaccination is the most important and effective weapon against this disease. In the past and at present, many advanced laboratories have been engaged in the development of new, more advanced types of anti-rabies vaccines. The current global trend in the production of rabies vaccines for veterinary and human use is towards the cultivation of the virus in tissue cultures with possible purification and inactivation of the virus (J. P. Soulebot at al.;: Medical prophylaxis of animal rabies: choice of an inactivated Vaccine. Ann. Virol (Inst Pasteur)

1982, 133E, 163 až 169.1982, 133E, 163 to 169.

P. Précausta at al.,: Modalites de production et immunite conferee par un vaccin antirabique inactive provenant de culture cellulaire. Comp. Immun. liicrobiol. infect.P. Précausta at al.,: Modalites de production et immunite conferee par un vaccin antirabique inactive sourcent de culture cellulaire. Comp. Immun. liicrobiol. infect.

Die., VOL. 5, Noe. 1 až 3, pp. 217 až 226, 1982).Die., VOL. 5, Noah. 1 to 3, pp. 217 to 226, 1982).

V CSSR se pro veterinární použití vyrábí vakcína proti vzteklině tkáňové z kmene VNUKOVO SAS - 32. V porovnáni s ostatními druhy antirabických vakcín vyráběných v CSSR nezpůsobuje postvakcinační reakce u pokusných vakcinovaných zvířat (V. Augustinský etalv, Neuroalergická aktivita antirabických vakcín. Vet. Med., Praha, 26, 1981, 6, 353 až 356). Výsledky ověřování připravených vakcín z tohoto kmene prokázaly, že buněčná antirabická vakcína z kmene VNUKOVO SAD - 32 je imunoganní a neškodná, vhodná k profylaktické imunizaci všech druhů domácích zvířat (Vrtiak at al.,: íiastkové závěrečná správa: Studium imunogennej a antigennej aktivity bunkovej antirabickej vakciny z kmeňa SAD - VNUKOVO. Výskumná úloha: P - 11 - 529 - 086, etapa P - 11 - 529 - 086 - 1/3: Studium profylaxe besnéty).In CSSR, a tissue rabies vaccine from the VNUKOVO SAS - 32 strain is produced for veterinary use. In comparison with other types of anti-rabies vaccines produced in CSSR, it does not cause post-vaccination reactions in experimental vaccinated animals (V. Augustinský et al., Neuroallergic activity of anti-rabies vaccines. Vet. Med., Prague, 26, 1981, 6, 353 to 356). The results of the verification of the vaccines prepared from this strain have shown that the cellular antirabies vaccine from the VNUKOVO SAD - 32 strain is immunogenic and harmless, suitable for prophylactic immunization of all types of domestic animals (Vrtiak et al.,: Partial final report: Study of immunogenic and antigenic activity of the cellular antirabies vaccine from the SAD - VNUKOVO strain. Research task: P - 11 - 529 - 086, stage P - 11 - 529 - 086 - 1/3: Study of rabies prophylaxis).

Přesto, že byly dosaženy dobré výsledky při zkouškách neškodnosti a imunogennosti, existuje u živých antirabických vakcín po aplikaci zvířatům nebezpečí změny vakcipačního kmene, kdy může dojít u vakcinovaných zvířat k onemocnění vzteklinou, jako je popisováno např. u živého vakcinačního kmene vztekliny ERA/James B. Esh et al.: Vaccine - induced rabies in four cats. JAVMA, VOL 180, NO. 11, 1 336 až 1 339/.Despite good results in safety and immunogenicity tests, there is a risk of change in the vaccine strain after administration to animals with live rabies vaccines, which can lead to rabies disease in vaccinated animals, as described, for example, with the live rabies vaccine strain ERA/James B. Esh et al.: Vaccine - induced rabies in four cats. JAVMA, VOL 180, NO. 11, 1 336 to 1 339/.

Uvedené riziko vede k vývoji nových vakcín proti vzteklině, kde virový antigen je inaktivován. V současné době se takové vakciny používají k preventivní a léčebné vakcinaci /Byron S. Berlin: Rhesus Diploid Rabies Vaccine Adsorbed, a new Rabies Vaccine. JAMA, March 26, 1982, VOL. 247, NO. 12, 1 726 až 1 728. Von P. Précausta: Eine inaktivierte Tollwut - Zellkulturvakzine ad us. vet.: Herstellungsverfahren und Ergebnisse immunologischer Untersuchungen. Sonderdruck, 37 Jahrgang, Nr. 4 vom 1, April 1982, Selte 274 až 281/.The mentioned risk leads to the development of new vaccines against rabies, where the viral antigen is inactivated. Currently, such vaccines are used for preventive and therapeutic vaccination /Byron S. Berlin: Rhesus Diploid Rabies Vaccine Adsorbed, a new Rabies Vaccine. JAMA, March 26, 1982, VOL. 247, NO. 12, 1 726 to 1 728. Von P. Précausta: Eine inaktivierte Tollwut - Zellkulturvakzine ad us. vet.: Herstellungsverfahren und Ergebnisse immunologische Untersuchungen. Sonderdruck, 37 Jahrgang, Nr. 4 vom 1, April 1982, Selte 274 to 281/.

Vhodnost použití neškodného adjuvans u antirabických vakcín z buněčných kultur pro urychlení tvorby protilátek byla experimentálně dokázána /Ό. Wiedermannová et al.: Specifická a nespecifická humorální odpověď u vakcinace očkovacími látkami proti vztekliněThe suitability of using a harmless adjuvant in anti-rabies vaccines from cell cultures to accelerate antibody production has been experimentally proven /Ό. Wiedermannová et al.: Specific and non-specific humoral response to vaccination with rabies vaccines

Rabivac a Vnukovo - 32. Oas. Lék. čes, 122, 1983, NO. 32 až 33, 980 až 983/.Rabivac and Vnukovo - 32nd Oas. Lék. čes, 122, 1983, NO. 32 to 33, 980 to 983/.

Podstatou vynálezu je inaktivovaná tkáňové vakcína proti vzteklině a způsob její přípravy.The essence of the invention is an inactivated tissue vaccine against rabies and a method of its preparation.

Inaktivovaná tkáňové vakcína proti vzteklině je určená k imunoprofylaxi vztekliny u psů, koček, skotu, ovcí, koní a ostatních hospodářských a domácích zvířat. Vyznačuje se tím, že v 1 cm³ obsahuje minimálně 333 333 MIC LB^/myš 8 až 10 g, i. c./lnak ti vo váného viru vztekliny kmene Vnukovo - 32/CAMP V-286/ v lyofilisovaném stavu. Její Imunogenní účinnost je stimulována zřeďovačem ve formě lipoidního adjuvans. Způsob výroby inaktivovaná tkáňová vakcíny proti vzteklině se vyznačuje tím, že kmen viru vztekliny Vnukovo - 32 /CAM? V 286/ se pomnoží na buněčných liniích křeččích ledvin v růstovém minimálním esenciálním médiu s přídavkem bovinního séra po dobu 6 až 8 dnů při teplotě 32 °C, až do dosažení minimálního ti tru 10⁴MIC LD-x/0,03 cm³, myš 8 až 10 g, i. c./ a potom se virus ^?u 60 inaktivuje účinkem beta propiolaktonu nebo radiačním ozářením Co a lyofilizuje se.Inactivated tissue vaccine against rabies is intended for immunoprophylaxis of rabies in dogs, cats, cattle, sheep, horses and other farm and domestic animals. It is characterized by the fact that in 1 cm ³ it contains at least 333 333 MIC LB^/mouse 8 to 10 g, ic/l inactivated rabies virus strain Vnukovo - 32 /CAMP V-286/ in a lyophilized state. Its immunogenic activity is stimulated by a diluent in the form of a lipoid adjuvant. The method of production of inactivated tissue vaccine against rabies is characterized by the fact that the rabies virus strain Vnukovo - 32 /CAM? V 286/ is propagated on hamster kidney cell lines in growth minimal essential medium with the addition of bovine serum for 6 to 8 days at 32 °C, until a minimum titer of 10 ⁴ MIC LD-x/0.03 cm ³ , mouse 8 to 10 g, ic/ is reached, and then the ^?u 60 virus is inactivated by the effect of beta propiolactone or Co radiation irradiation and lyophilized.

Vakcína představuje suspenzi inaktivovanáho viru vztekliny, růstové médium, lyofilizační médium a olejový zřeďovač, který slouží zároveň jako adjuvans vakcíny.The vaccine is a suspension of inactivated rabies virus, growth medium, lyophilization medium, and an oil diluent, which also serves as a vaccine adjuvant.

Komponenty pro přípravu inaktivovaná tkáňová vakcíny proti vzteklině:Components for the preparation of inactivated tissue rabies vaccine:

1. Kmen viru vztekliny1. Rabies virus strain

2. Buněčná kultura pro pomnožení viru vztekliny2. Cell culture for rabies virus propagation

3. Růstové a udržovací médium3. Growth and maintenance medium

4. Antibiotika4. Antibiotics

5. Inaktivačni činidlo a způsob provedení inaktivace viru vztekliny5. Inactivation agent and method for performing rabies virus inactivation

6. Lyofilizační médium pufrované koncentrované6. Buffered concentrated lyophilization medium

7. Zřeďovač a adjuvans vakcíny s7. Vaccine diluent and adjuvant with

ad 1. Pro výrobu vakcíny proti vzteklině tkáňové inaktivované je používán kmen viru vztekliny Vnukovo - 32 /uložený v československé sbírce mikroorganismů, sbírce zoopatogenních mikroorganismů. Výzkumný ústav veterinárního lékařství, Brno 21, Medlánky, pod inventárním číslem CAPM V- 286/.ad 1. For the production of tissue inactivated rabies vaccine, the rabies virus strain Vnukovo - 32 is used /stored in the Czechoslovak Collection of Microorganisms, Collection of Zoopathogenic Microorganisms. Veterinary Research Institute, Brno 21, Medlánky, under inventory number CAPM V- 286/.

ad 2. Buněčná kultura pro kultivaci výše uvedeného kmene je buněčná linie křeččích ledvin /označení linie BHK - 21/.ad 2. The cell culture for cultivating the above strain is a hamster kidney cell line /line designation BHK - 21/.

ad 3. Složení růstového minimálního esenciálního média /MEM/:ad 3. Composition of growth minimal essential medium /MEM/:

MEM roztok 1Ox koncentrovaný MEM solution 1Ox concentrated 100 100 cm³ ^cm3 Sérum bovinni ultraflltrované inaktivované pro tkáňové Bovine serum ultrafiltered inactivated for tissue cm³ ^cm3 kultury cultures 50 50 Penicilín /PNC/ zásobní roztok Penicillin /PNC/ stock solution 5 5 cm³ ^cm3 Streptomycin /STM/ zásobní roztok Streptomycin /STM/ stock solution 2,5 2.5 cm³ ^cm3 Pungicidin zásobní roztok Pungicidin stock solution 3 3 cm³ ^cm3 7,5% roztok hydrouhličitanu sodného /KaHCO-/ 7.5% sodium bicarbonate solution /KaHCO-/ 8 8 cm³ ^cm3 Voda pro tkáňové kultury /TK/ Water for tissue culture /TK/ 900 900 cm³ ^cm3

Složeni udržovacího minimálního esenciálního média /MEH/:Composition of maintenance minimum essential medium /MEH/:

100 cm³-5- cm³ 100 ^cm3 -5- ^cm3

MEM roztok lOx koncentrovaný PNC zásobní roztokMEM solution 10x concentrated PNC stock solution

STJÍ zásobní roztokSTJI stock solution

Pungicidin zásobní roztokPungicide stock solution

7,5% roztok WaHCOj7.5% solution of NaHCO3

Voda pro TK ad 4. Pro růstová a udržovací média konc en tr ac ich:Water for TK ad 4. For growth and maintenance media concentrates:

Zásobní roztok penicilinu: Penicilin G 10 mil. m. j.Penicillin stock solution: Penicillin G 10 million IU.

Zásobní roztok střeptomycinu:Streptomycin stock solution:

Zásobní roztok fungicidinu:Fungicide stock solution:

2,5 cm^ 3 cnp 8 cm^2.5 cm^ 3 cm^ 8 cm^

900 cm^ jsou použita antibiotika v následujících900 cm^ antibiotics are used in the following

Voda tridestilované sterilní ad 300 cop Střeptomycin sulfát 5 g Voda tridestilované sterilní ad 300 cm^ Fungicidin 20 gWater, triple distilled, sterile, ad 300 cop Streptomycin sulfate 5 g Water, triple distilled, sterile, ad 300 cm^ Fungicide 20 g

Etylenglykol p. a. ad 2 000 cop ad 5 způsobů:Ethylene glycol p. a. ad 2,000 cop ad 5 ways:

Virus vztekliny se inaktivuje podle výrobních podmínek jedním z následujících a/ beta - propiolaktonem v koncentraci 0,025 % až 0,05 % b/ radiačním zářením Co^° tak, aby dávka absorbovaného záření doséhla 25 lcGy/2,5 Mrad/ ad 6. Složení lyofilizačního média pufrovaného koncentrovaného:Rabies virus is inactivated according to the production conditions by one of the following a/ beta-propiolactone in a concentration of 0.025% to 0.05% b/ Co2 radiation so that the absorbed radiation dose reaches 25 lcGy/2.5 Mrad/ad 6. Composition of the buffered concentrated lyophilization medium:

Želatina 250 gGelatin 250 g

Sacharóza 375 gSucrose 375 g

Hydrofosforečnan sodný /NagHPO^ x 12 HgO 12 gSodium Hydrophosphate /NagHPO^ x 12 HgO 12 g

Dihydrofosforečnan draselný /KHgŘO^ . 1,125 gPotassium dihydrogen phosphate /KHgØO^ . 1.125 g

Voda redestilovaná ad 1 000 cm^ ad 7. Složení solvens a adjuvans:Redistilled water ad 1,000 cm^ ad 7. Composition of solvents and adjuvants:

Olej vazelínový medicinální λ1 24 000 gMedical Vaseline Oil λ1 24,000 g

Lanolin 8 000 gLanolin 8,000g

Tween (Estery sorbitanu s vyššími mastnými kyselinami) 1 600 gTween (Sorbitan esters with higher fatty acids) 1,600 g

Voda redestilovaná 66 400 gRedistilled water 66,400 g

Popis příkladu provedení:Description of the example:

a/ Subpasáže z dobře narostených tkáňových kultur linie BHK 21 ve stáří 3 až 4 dnů jsou opracovány trypsinem. Získaná buněčné suspenze se infikuje virem vztekliny Vnukovo 32 ve 108. pasáži a vyšší v dávce 0,01 až 0,001 MIC LD^₀ viru na 1 buňku. Suspenze buněk a viru se nechá adsorbovat za stálého míchání při pokojové teplotě 20 °C. Infikované buňky se resuspendují v médiu MEM s 5 % hovězího séra na hustotu 50 000 až 100 000 buněk v 1 cm\ Infikované buněčná suspenze se rozplní do Roux lahví a 1 200 cm^ po 100 az 120 cm\ Sběry viru se provádíjí 6 až 8 den po nasazení infikované buněčné suspenze. ?ro výrobu vakcíny se používají sběry viru o minimálním titru MIC LD^q10⁴/0,03 cm^, myš 6 až 8 g, i. c./.a/ Subpassages from well-established tissue cultures of the BHK 21 line at the age of 3 to 4 days are treated with trypsin. The obtained cell suspension is infected with the Vnukovo 32 rabies virus at the 108th passage and higher at a dose of 0.01 to 0.001 MIC LD^ ₀ of virus per 1 cell. The cell and virus suspension is allowed to adsorb with constant stirring at room temperature of 20 °C. The infected cells are resuspended in MEM medium with 5% bovine serum to a density of 50,000 to 100,000 cells per 1 cm\ The infected cell suspension is filled into Roux bottles and 1,200 cm^ by 100 to 120 cm\ Virus harvests are carried out 6 to 8 days after the infected cell suspension is used. For the production of the vaccine, virus collections with a minimum titer of MIC LD^q10 ⁴ /0.03 cm^, mouse 6 to 8 g, ic/ are used.

Vhodný vzteklinový antigen se smísí v. poměru 9 dílů viru s 1 dílem lyofilizačního média pufrovaaého koncentrovaného. Vzteklinový antigen lyofilizačním médiem se rozplní do lékovek a zmrazí. Pak se provede lyofilizace vakcíny nejšetrnějším způsobem /v průběhu lyofilizace nesmí teplota produktu překročit 25 °C. Požadovaná zbytková vlhkost lyofilizátu musí být nižěí než 3 %· Lyofilizovaná vakcína je uzavřena gumovou zátkou ve vakuované lékovce.The appropriate rabies antigen is mixed in a ratio of 9 parts of virus with 1 part of concentrated buffered lyophilization medium. The rabies antigen is filled into vials with the lyophilization medium and frozen. Then the vaccine is lyophilized in the most gentle way / during lyophilization, the product temperature must not exceed 25 °C. The required residual moisture of the lyophilizate must be less than 3%. The lyophilized vaccine is closed with a rubber stopper in a vacuum vial.

**

Lékovky s vakcinou jsou převezeny k inaktivaci ozářením Co®® v dávce 25 kGy/2,5 Mrad/. K vakcíně se připraví lipoidní adjuvans, které je současně zřeňovačem vakcíny. Uvedené komponenty solvens se emulgují a rozplní do lékovek. Lékovky se neprodyěně uzavřou a jejich obsah se sterilizuje autoklávováním. Vakcína s« k aplikaci připraví tak, že lyofilizát se rozpustí v lipoidním adjuvanse.The vials with the vaccine are transported for inactivation by Co®® irradiation at a dose of 25 kGy/2.5 Mrad/. A lipoid adjuvant is prepared for the vaccine, which is also the diluent of the vaccine. The solvent components are emulsified and filled into the vials. The vials are tightly closed and their contents are sterilized by autoclaving. The vaccine is prepared for administration by dissolving the lyophilisate in the lipoid adjuvant.

U každé vyrobené šarže vakcíny se provádí výstupní kontrola na zkoušku neškodnosti, účinnosti, sterility, stanovení pH, vlhkosti, vzhledu, vakua a průkaz inaktivace viru vztekliny ve vakcíně.Each batch of vaccine produced undergoes final inspection to test for harmlessness, efficacy, sterility, pH, moisture, appearance, vacuum, and proof of inactivation of the rabies virus in the vaccine.

b/ Po získání vhodného vzteklinového antigenu pro výrobu antirabické vakcíny /popis viz příklad provedení a/ je provedena jeho okamžitá inaktivace beta - propiolaktonem v koncentraci 0,025 % až 0,05 % po dobu 24 hodin při teplotě 4 °C s následnou úpravou pH na hodnotu 6,5 až 8,0. Takto inaktivovaný rabický virus je smíchán s lyofilizaSním médiem pufrovaným koncentrovaným, rozplněn do lékovek, zmražen a lyofilizován. Po lyofilizaci jsou provedeny kontrolní zkoušky v rozsahu popsaném v příkladu provedení a/.b/ After obtaining a suitable rabies antigen for the production of an anti-rabies vaccine /for description see embodiment a/, its immediate inactivation is carried out with beta-propiolactone in a concentration of 0.025% to 0.05% for 24 hours at a temperature of 4 °C with subsequent adjustment of the pH to a value of 6.5 to 8.0. The rabies virus inactivated in this way is mixed with a concentrated buffered lyophilization medium, filled into vials, frozen and lyophilized. After lyophilization, control tests are carried out to the extent described in embodiment a/.

Možnosti využití vynálezu:Possibilities of using the invention:

Inaktivovaná tkáňová vakcína proti vzteklině byla pokusně vyrobena a ověřovánu v rámci laboratorních zkoušek u následujících druhů zvířat: psi, kočky, Skot, kont, ovce. Ověřování bylo prováděno u výše jmenovaných druhů typy vakcín /inaktivovaných Co^b0 a . beta - propiolaktonem/.Inactivated tissue vaccine against rabies was experimentally produced and verified in laboratory tests in the following animal species: dogs, cats, cattle, pigs, sheep. Verification was carried out in the above-mentioned species and vaccine types /inactivated with Co ^b0 and . beta - propiolactone/.

Bylo použito následující imunizačni schéma a tyto vakcinační dávky:The following immunization schedule and vaccine doses were used:

Koně, skot - vakcinační dávka 5 cnp vakcíny aplikované i. m., revakcinace za 3 týdny stejnou dávkou a způsobemHorses, cattle - vaccination dose of 5 cnp vaccine administered i. m., revaccination in 3 weeks with the same dose and method

Ovce - vakcinační dávka 4 cnP vakcíny aplikované i. m., revakcinace za 3 týdny stejnou dávkou a způsobemSheep - vaccination dose of 4 cnP vaccine administered i. m., revaccination in 3 weeks with the same dose and method

Psi - vakcinační dávka 3 cnp vakcíny aplikované i. m., revakcinace za 3 týdny stejnou dávkou a způsobemDogs - vaccination dose 3 cnp vaccine administered i. m., revaccination in 3 weeks with the same dose and method

Kočky - vakcinační dávka 1,5 ca^ vakcíny aplikované 1. m., revakcinace za 3 týdny atejnou dávkou a způsobemCats - vaccination dose 1.5 ca^ of vaccine applied on the 1st month, revaccination in 3 weeks with the same dose and method

Při aplikaci ve výše uvedených dávkách a launizačním postupu vykazovaly inaktivovaná tkáňová vakcíny proti vzteklině dobré imunizační schopnosti zjiětované imunitní odpovědí vakcinovaných zvířat detekcí virus neutralizujících protilátek /VHP/.When applied in the above doses and the immunisation procedure, inactivated tissue vaccines against rabies showed good immunising abilities as assessed by the immune response of vaccinated animals by the detection of virus neutralising antibodies (VNA).

Během ověřování nabyly u uvedených druhů pozorovány postvakcinačnl reakce po vakcinaci či ravakcinaci u obou typů inaktivovaných vakcín.During the verification, post-vaccination reactions were observed in the above species after vaccination or revaccination with both types of inactivated vaccines.

Vakcinační schéma pro koně, skot, psy, kočky a ovce při výše uvedených dávkách je následující:The vaccination schedule for horses, cattle, dogs, cats and sheep at the above doses is as follows:

'238794'238794

1. Vakcinace od 3 měsíců stáří zvířete.1. Vaccination from 3 months of age of the animal.

2. Revakcinace za 3 týdny po první vakcinaci.2. Revaccination 3 weeks after the first vaccination.

3. Revakcinace ví 1-roce stáří zvířete.3. Revaccination is done when the animal is 1 year old.

4. Pravidelné roční revakcinace.4. Regular annual revaccinations.

Dosažené průměrné titry VHP detekované sérum neutralizačním testem proti LD^40 standardního čelenžního viru vztekliny /kmen CVS/ u jednotlivých druhů vakcinovaných zvířat /standardní test podle Atanasiu a Lépine/.Average VHP titers achieved detected by serum neutralization test against LD^40 of standard challenge rabies virus /CVS strain/ in individual species of vaccinated animals /standard test according to Atanasio and Lépine/.

Druh zvířete Type of animal Stanoveni Determination za for Vzteklina inakt. ozářením Rabies inactivated by irradiation Vzteklina inakt beta-propion Rabies inactive beta-propion Koně Horses 90 dnů po 90 days after revakcinaci revaccination 1:18 1:18 1:11 1:11 Skot Cattle 90 dnů po 90 days after revakcinaci revaccination 1:10 1:10 1:15 1:15 Psi Dogs 65 dní po 65 days after revakcinaci revaccination 1:48 1:48 1 :30 1:30 Kočky Cats 65 dní po 65 days after revakcinaci revaccination 1:5 1:5 1:5 1:5 Ovce Sheep 60 dní po 60 days after revakcinaci revaccination 1:15 1:15 1:15 1:15

PŘEDMET VYNÁLEZUSUBJECT OF THE INVENTION

Claims

An inactivated rabies tissue vaccine for the immunoprophylaxis of rabies in dogs, cats, cattle, horses, sheep and other farm and domestic animals, characterized in that the 1 cm @ 3 vaccine contains at least 333,333 MIC DD ^ / mouse 8-10 g , ic / inactivated rabies virus of the Vnukovo-32 CAMP V-286 strain in the lyophilized state.

2. The inactivated rabies tissue vaccine of claim 1, comprising a diluent in the form of a lipoid adjuvant.

3. A method for producing an inactivated rabies tissue vaccine according to items 1 and 2, characterized in that rabies virus 32-CAMP V-286 / is propagated on hamster kidney cell lines in growth minimal essential medium with the addition of bovine serum for 6 hours. up to 8 days at 32 ° C until the minimum virus titer is reached

MIC LDj--O (mouse, 8 to 10 g, 0.03 cm ^, i.c.) and then harvested virus is inactivated by b “60 by beta-propiolactone or by radiation irradiation with Co

4. The process according to claim 3, characterized in that during production is used to infect cells of hamster kidney rabies virus in a dose of 0.001 to 0.01 LD MIC ^ ₀ 1 virus to the cell and allowed to adsorb for 2 hours with stirring at room temperature 20 ° C.

5% bovine serum to a density of 50,000 to 100,000 cells per cm.

A method according to claim 3, characterized in that the multiplied rabies virus is harvested on hamster kidney cells.

5. The method of claim 3, wherein the rabies virus infected kidney cells are resuspended in a growth minimal essential medium with the addition of i.

6 to 8 days post-infection, reaching the minimum MIC titer of LD-γ10 of ⁴ / 0.0 cm < -1 >, mouse 8-10 g, ic /.

7. The method of claim J wherein beta-propiolactone is used to inactivate the harvested rabies virus at a concentration of 0.025% to 0.05% for 24 hours at 4 [deg.] C, followed by adjusting the pH to 6.5. to 8.0, or inactivation by radiation radiation Co ^bb so that the dose of adsorbed radiation reaches 25 kOy.

. 8. The process of claim 3, wherein the inactivated rabies virus is mixed with a lyophilization medium containing 3.75% gelatin and 2.5% sucrose in a final blend, vialed, frozen and lyophilized.