CS237699B1 - Způsob přípravy peroxidasy - Google Patents

Abstract

Způsob připravy peroxidasy z brukve zelné, kedlubny nebo křenu spočívá v exhalaci vodou rozmělněné suroviny, při sráženi exhalátu a rafinaoi. Rafinace se provádí tak, že se surový vodný roztok peroxidasy po přesrážení nechá projít vrstvou nízkoporézního gelu s vylučovací mezí v oblasti 1 000 až 30 000. Eluent se jímá ve frekvencích podle požadovaná čistoty a specifické aktivity. Podíl s nízkou specifickou aktivitou se vrací do stádia sráženi.

Description

Vynález se týká zlepšeného způsobu přípravy peroxidasy z přírodních materiálů, z brukve zelné, (Brassica oleracea L., var. gongylodos L.), kedlubny Gigant a z křenu (Armoracia rusticana).Tonto způsob používá k rafinaci gelovou filtrací surového enzymu.

Průmyslově se peroxidasa, enzym katalyzující v živočišných i rostlinných tkáních rozklad peroxidu vodíku, získává výhradně z křenu (např. Armoracia rusticana)· Obsah tohoto enzymu, který še jinak nachází prakticky ve všech živých organismech, je totiž v převážné většině potenciálních zdrojů natolik nízký, že izolace z těchto surovin by nebyla efektivní. Teprve nedávno bylo nalezeno, že peroxidasu lze i2olovat v dobrém výtěžku z brukve zelné, kedlubny, s výhodou nové odrůdy Gigant.

Peroxidasa základní nižší kvality se připravuje několikanásobným srážením vodného extraktu suroviny síranem amonným, nebo vodorozpustnými rozpouštědly jako je aceton, methanol ethanol a podobně. Získaný produkt se zbavuje zbytků nízkornolekulárních srážedel dialýzou, což je operace poměrně náročná na zařízení, ale především je zdlouhavá,a tedy i zdrojem ztrát aktivity. Roztok po dialýze ,

-tjbJ, retentát, se podrobuje finálnímu mrazovému sušení lyofilizaci. Sleduje-li se při přípravě získání produktu vyšší kvality, rafinuje se dále produkt základní kvality některou z chromátografických metod, tj, iontovýměnnou chromatografií na diethylaminoethylcelulóze nebo karboxymethylceluloze, nebo gelovou či afinitní chromatografií, obvykle však kombinací alespoň dvou způsobů.

Při zkoumání chování nově inolované peroxidasy z brukve zelné, kedlubny bylo s překvapením zjištěno, že podstatný podíl bílkovinných příměsí, znečišťujících peroxidasu získanou prostým násobným přesrážením extraktu obdrženého vylisováním rozemleté suroviny tvoří

237 699 látky poměrně nízkomolekulární , které se oddělují při geloVe chromatografii i na takových gelech, které se běžně používají jen k odsolování· Toto zjištění, platné i pro isolaci peroxidasy z křenu, je využito u nově navrženého způsobu přípravy peroxidasy, který-je předmětem tohoto vynálezu»

Podle tohoto nového způsobu se postupuje tak, že zdroj peroxida3y_? , jímž může být např. brukev zelná, kedlubny, nebo křen, se rozmělní a získaná měl se vylisuje. Pevné zbytky se mohou případně nechat nasáknout dalším podílem vody a lisování znovu zopakovat. Spojené filtráty se dále. zbaví suspendovaných drobných částeček filtrací přes vrstvu křemeliny a peroxidasa se vysráží buď rozpouštěním anorganické soli jako např. síranu amonného, nebo přidáním organického rozpouštědla, jakým je například aceton. Sraženina surové peroxidasy se ixoluje v prvém případě nejlépe filtrací přes vrstvu křemeliny, v druhém odstředěním. Dalšího stupně rafinace se dosáhne extrakcí získaného koláče, nebo sedimentu odměřeným množstvím vody a frakčním vysrážením peroxidasy. Prakční srážení se provádí stejnými nebo obdobnými činidly jako první srážení. Roztok peroxidasy, který se získá novou extrakcí filtračního koláče, nebo sedimentu po frakčním srážení se bez jakýchkoliv úppav podrobí gelové chromatografii , nechá se projít vrstvou nízkoporesního gek» a vylučovací mezí v oblasti 1000 až 30 000. Přitom se cKřomatografovaný materiál rozdělí do několika frakcí podle požadované čistoty a specifické aktivity. Jako první putuje vrstva obsahující globule peroxidasy vázané slabými vazbami k vysokomolekulárním organickým přímíšeninám. Tuto frakci je výhodné recirkulovat do další násady před srážení , kde lze tyto látky oddělit. Dále následuje vrstva vyčištěné peroxidasy. Iaolací její vhodné úzké frakce lze jako část produkce získávat přímo i peroxidasu špičkové kvality, charakteriaovanou hodnotou RZ 3 ( Čí slo RZ je kritérium vyjádřené poměrem absorbancí vodného roztoku peroxidasy při 403 a 275 ftm, kterým se hodnotí přítomnost cizích bílkovin. Absorpce-při 403 hto je charakteristická pro ferriprotoporfyrinovou skupinu enzymu,· absorpce při 275 nm pro bílkoviny). Do finální formy se získané roztoky převédou mrazovým sušením (lyofilizací). Jako poslední odchází frakce balastních látel^ tato frakce

- 3 237 699 je žlutá, a srážedla. Po vytečení této frakce je kolona připravena k novému použití.

Postupýsdle tohoto vynálezu je výhodný zejména tím, že zavádí zjednodušený způsob izolace a rafinace, gelovou chromátografii na úzkopórových gelech. Nahrazuje tak zdlouhavou dialýzu a následnou rafinaci jedinou operací, čímž celý proces přípravy peroxidasy významně urychluje a zkvalitňuje zamezením ztrát, vznikajících až doposud při dlouhodobých a opakovaných rafinačních procesech.

Peroxidasa sé používá převážně ke zhotovování diagnostických materiálů ve zdravotnictví (důkaz glukosy, cholesterolu).

Čisté preparáty ( RZ 3) se využívají pro značkování a detekci v hic· tochemii a cytochemii.

Způsobpdle vynálezu jo blíže popsán v následujících příkladech! Příklad 1

634 g kedluben odrůdy Gigant, které byly 10 dnů dozrávány při laboratorní teplotě, bylo rozraixováno se stejným hmotovým dílem vody v dávkách po 400 g v mixéru ETA 1-012. Získaná měl byla vymačkána v polypropylenové filtrační plachetce, nejdříve po částech v rukách a pak ještě všechna najednou lisováním mezi dvěma deskami 400 x 300 mm stahováním čtyř šroubů U 10 v rozích desek. Bylo tak získáno 8 665 g roztoku o celkové aktivitě 1 330 0Θ0 PPG a 1 408 g filtračního koláče se zbytkovou aktivitou 170 000 PPG. (PPG -purpurogallinová jednotka referuje k počtu miligramů purpurogallinu, které se vyloučí katalytickým působením peroxidasy na roztok pyrogalolu a peroxidu vodíku za standardních podmínek definovaných v publikaci J, Davídkai Laboratorní příručka analýzy potravin, SIíTL, Praha 1977 na straně 66l). Koláč byl vyhozen , filtrát byl ponechán přes noc při teplotě kolem 4 °C a ráno byl zbaven suspendovaných pevných částic filtrací přes 50 g křemeliny, naplavené na filtrační papír na Buchnerově nálevne o průměru 250 mm. Filtrování roztoku bylo napomáháno obnovováním povrchu filtrační plochy stíráním špachtlí, Takto byla filtrace ukončena za dvě hodiny,Aktivita peroxidasy ve filtrátu se nezměnila, K filtrátu pak bylo přidáno 5,5 kg síranu amonného kvality čistý a po rozpuštění a dvou hodinách stání byla suspenze peroxidasy zfiltrována přes 5θ g křemeliny stejnou

- 4 237 899 technikou, jaká je popsána výše. Filtrát vykazoval aktivitu

000 PpG, zbytek peroxidasy se z něj nevylučoval ani delším stáním a byl proto zlikvidován. Filtrační koláč byl extrahován 400 a 300 ml vody, vždy tak, že koláč byl vyjmut, 10 minut míchán s určeným množstvím vody při laboratorní teplotě a suspense'byla pak zfiltrována. První extrakce poskytla 430 g roztoku s aktivitou 570 000 PPG a druhá 34θ g roztoku o .aktivitě 280 000 PPG. Filtráty byly spojeny za míchání a k nim bylo při normální teplotě přidáno 140 g síranu amonného kvality p.a. Po rozpuštění stála směs tři hodiny při teplotě 4 ^υ0 a puk byla odstředěna na odstředivce JaΪ-23 (10 min. při 6 000 1/min·)· Sediment mol 95 000 PPG a h supornatantu bylo přidáno 40 ml peroxidasy z minulého pokusu,(získaných jako okrajové frakce při gelové chromátografii (viz dále/, o aktivito 230 000 PPG a 300 g síranu amonného a po rozpuštění síranu byla směs při teplotě 4 °C ponechána do druhého dne. Vzniklá suspense peroxidasy pak byla zfiltrována přes 10 g křomeliny· Filtrát byl neaktivní a byl vyhozen, filtrační koláč byl extrahován dvakrát čtyřiceti mililitry vody stejnou technikou, jaká jo popsána výše, čímž so získalo 97 g filtrátu s peroxidasou o aktivitě 1 300 000 PPG. Roztok peroxidasy pak byl přečištěn chromatografií na kolono o průměru 37 mm a s výškou náplně 460 mm. kolona byla naplněna gelem s vylučovací mezí 1 500<30 000 (Sephadex G-50 Fine, výrobce Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Švédsko). Chromatografie byla provedena ve čtyřech násadách s rychlostí toku 4 ml. min. “« Bylo získáno celkem 122 g hlavního podílu o aktivitě 595 000 PPG a 280 g okrajových frakcí s aktivitou 705 000 PPG,

Frakce byly spojovány na základě měření hodnot RZ, které bylo požadováno lepší než 0,75. Lyofilizace hlavního produktu byla provedena vo· dvou šaržích při absolutním tlaku 30 P. Bylo získáno 0,33 g pro;ktu o PZ

0,90 a spocif:

ké aktivito 1 200 PPG/mg.

oysy nasycen; o

Okrajové frakce z chromatografie na Sephadexu G-50 (288 g) y 180 g síranu amonného a po stání přes noc při teplotě 4 C byla peroxidasa oddělena filtrací přes 10 g křemeliny· Neaktivní filtrát byl vyhozen, filtrační koláč byl extrahován dvakrát mililitry vody. 6'.

extsaktu obsahovalo peroxidasu o aktivitě 700 000 PPG, C íromatografií na Sephadexu G-50 (kolona o průměru 27 mm. výška 290 mm) ve třech dávkách bylo získáno 64 g roztoku o aktivito 507 000 PPG a 40 g okrajových frakcí o aktivitě 180 000 PPG,

- 5 237 699 které byly recyklovány pro další pokus„ Lyofilizací. hlavních frakcí v jedné dávce bylo získáno 0,35 g peroxidasy o RZ = 0,68 a specifické aktivitě 1046 PPG/mg·

Celkem tedy bylo získáno bez ohledu na odlišnost hodnot RZ malý rozdíl v aktivitě·recyklů i specifické aktivitě obou podílů produktu z 5 634 g kedluben 0,68 g peroxidasy o aktivito 762 000 PPG (57,3 % aktivity původního extraktu), resp. 50,8 % původní aktivity suroviny’·

Příklad

Pokus popsaný v příkladu 1 byl opakován s výchozím množstvím

385 g kedlubny odrůdy Gigant. Při první gelevé chromátografii byla odebrána úzká frakce o hmotnosti 11 g, která byla lyofilizována zvlášt. Pokus byl dále dokončen tak, jak je popsáno v příkladu

1. Bylo získáno 0,045 g peroxidasy o RZ 3,1 a specifické aktivitě

400 PPG/mg, 0,260 g peroxidasy o RZ 0, 93 a spec. aktivitě 1 200 PPG/mg a 0,290 g peroxidasy o RZ 0,63 a spec. aktivitě 1 020 PPG/mg. Příklad 3

Pokus popsaný v příkladu 1 byl opakován. Namísto síranu amonného byl však ke srážení používán aceton. Teplota obou kapalin (roztoku peroxidasy a acetonu) byla před míšením snížena na -5 °C a během míšení byla směs ještě dále chlazena, aby její teplota nepřestoupila -4 °θ· K úplnému vysrážení peroxidasy byl brán 1,7 objemový násobek acetonu, k frakěnímu srážení 0,4 násobek. Zpracováváním 4 023 g kedluben Gigant bylo získáno 0,25 g peroxidasy o RZ 1,1 a specifické aktivitě 1 300 PPG/mg a 0,21 g peroxidasy o RZ 0,72 a specifické aktivitě 1 050 PPG/mg.

Příklad 4

Pokus popsaný v příkladu 1 byl opakován, namísto gelu o vylučovací mezi 1 500 až 30 000 (Sephadex G-50)byl však k chromatografii vzat gel s vylučovací mezí 1 000 & 5 000 (Sephadex G-25^ Z

030 g kedluben Gigant bylo získáno 0,38 g peroxidasy o RZ 1,05 a specifické aktivitě 1100 PPG/mg.

- 6 Příklad 5 237 BBS

Postup dle příkladu 1 byl opakován, namísto kedluben odrůdy

Gigant však bylo ke zpracování vzato 4 895 g křenu selského (Armoracia rusticana), který byl před rozmělněním v mixeru dva dny máčen v tekoucí vodě. Roztok získaný trojnásobným vylisováním drti se stejným hmotovým dílem vody obsahoval peroxidasu o celkové akti víte 1 720 000 PPG a jeho zpracováním podle postupu popsaného v příkladě 1 bylo získáno 0,495 g peroxidasy o RZ 1,13 a specifické aktivitě 1 736 PPG,

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   237 699

   Způsob přípravy peroxidasy z brukve zelné, kedlubny, Brassica oleracea L., var. gongylodes L., s výhodeu odrůdy Gigant neb® křenu extrakcí rozmělněné suroviny vodou, přesréžením extraktu & refinací, vyznačený tím, že se surový vodný roztok peroxidasy po přesrážení neché projít vrstveu nízkoporézníha· gelu s vylučovací mezí v oblasti 1 000 až 50 000, přičemž z eluentu získaného ve frakcích podle paže dováné čistoty a specifické aktivity se podíl s nízkou spe cifickou aktivitou vrací der stédia srážení.