RU2087150C1 - Способ получения церулоплазмина - Google Patents
Способ получения церулоплазмина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2087150C1 RU2087150C1 SU5012277/14A SU5012277A RU2087150C1 RU 2087150 C1 RU2087150 C1 RU 2087150C1 SU 5012277/14 A SU5012277/14 A SU 5012277/14A SU 5012277 A SU5012277 A SU 5012277A RU 2087150 C1 RU2087150 C1 RU 2087150C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ceruloplasmin
- preparing
- purity
- centrifuged
- protein
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу получения ферментного препарата - церулоплазмина и может быть использовано при производстве медицинских препаратов. Цель изобретения - повышение чистоты целевого продукта. Сырье (сыворотка, осадок Б) гомогенизируют в ацетатном буфере и центрируют. ДЭАЭ-сефадекс добавляют к центрифугату и перемешивают. Церулоплазмин элюируют градиентом хлористого натрия. Элюат диафильтрацией или разведением переводят в условия, необходимые для выпадения высокомолекудярных примесей: концентрация белка 0,5 - 2%, pH 5,1 - 5,4, ионная сила 0,01 - 0,04, затем подвергают отстаиванию в течение 6 - 12 часов, центрифугируют и концентрируют ультрафильтрацией. Чистота целевого продукта - 95 - 99%, выход - 70 - 80%. 2 табл., 1 ил.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к получению препаратов из сыворотки крови.
Известен способ получения церулоплазмина (ЦП) из сыворотки крови, включающий:
1) экстракцию осадка III (Б) фосфатным буфером (ФБ) 0,02 М pH 6,5 -7,8;
2) хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе в том же буфере, с последующей отмывкой 0,02 М ФБ с 0,05 М хлористого натрия и элюцией 0,02 М ФБ pH 6,8 с 0,18 М хлористого натрия;
3) стадию денатурации двухкратное осаждение ЦП 3 объемами этанола при комнатной температуре.
1) экстракцию осадка III (Б) фосфатным буфером (ФБ) 0,02 М pH 6,5 -7,8;
2) хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе в том же буфере, с последующей отмывкой 0,02 М ФБ с 0,05 М хлористого натрия и элюцией 0,02 М ФБ pH 6,8 с 0,18 М хлористого натрия;
3) стадию денатурации двухкратное осаждение ЦП 3 объемами этанола при комнатной температуре.
Выход ЦП составил 2 г/кг осадка Б (III).
Недостатками известного способа являются:
использование на стадии денатурации высокой концентрации этанола при комнатной температуре приводит к снижению активности ЦП в результате нарушения нативной структуры белка;
чистота конечного продукта 80% [1]
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения ЦП, состоящий из:
1) экстракции ЦП из осадков (IV, IV-I, III по Кону VI) 0,05 М ацетатным буфером (АБ) pH 7,0 ±0,1 с 0,05 М NaCl;
сорбции на ДЭАЭ-сефадексе А-50 (ДЭАЭ) в том же буфере, с последующей отмывкой тем же буфером и градиентной элюции NaCl 0,05 0,3 М в том же буфере;
кристаллизации в течение 3 5 дней. Выход 60% [2]
Использование в данном способе градиентной хроматографии и кристаллизации взамен стадии денатурации позволяет повысить чистоту до 90 95% и оксидазную активность до 34 ед/мг белка по Равину [3]
Однако метод, как и другие известные способы, не предусматривает освобождения ЦП от высокомолекулярных примесей (аггрегированный ЦП, липиды), которым приписывают побочные эффекты: перекисное окисление липидов, тромбообразующая активность, агрегация тромбоцитов [4]
Кроме того, кристаллизация длится 3 -5 суток, что нетехнологично, а перевод белка из растворимого состояния в осадок приводит к его частичной денатурации. При выделении ЦП по способу-прототипу в наших опытах из осадка Б (III), содержащего больше 50% липидов плазмы, кристаллизация не происходила даже через 6 дней в связи с высокой вязкостью раствора, обусловленного высоким содержанием липидов, 0,1 0,15 г/г белка.
использование на стадии денатурации высокой концентрации этанола при комнатной температуре приводит к снижению активности ЦП в результате нарушения нативной структуры белка;
чистота конечного продукта 80% [1]
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения ЦП, состоящий из:
1) экстракции ЦП из осадков (IV, IV-I, III по Кону VI) 0,05 М ацетатным буфером (АБ) pH 7,0 ±0,1 с 0,05 М NaCl;
сорбции на ДЭАЭ-сефадексе А-50 (ДЭАЭ) в том же буфере, с последующей отмывкой тем же буфером и градиентной элюции NaCl 0,05 0,3 М в том же буфере;
кристаллизации в течение 3 5 дней. Выход 60% [2]
Использование в данном способе градиентной хроматографии и кристаллизации взамен стадии денатурации позволяет повысить чистоту до 90 95% и оксидазную активность до 34 ед/мг белка по Равину [3]
Однако метод, как и другие известные способы, не предусматривает освобождения ЦП от высокомолекулярных примесей (аггрегированный ЦП, липиды), которым приписывают побочные эффекты: перекисное окисление липидов, тромбообразующая активность, агрегация тромбоцитов [4]
Кроме того, кристаллизация длится 3 -5 суток, что нетехнологично, а перевод белка из растворимого состояния в осадок приводит к его частичной денатурации. При выделении ЦП по способу-прототипу в наших опытах из осадка Б (III), содержащего больше 50% липидов плазмы, кристаллизация не происходила даже через 6 дней в связи с высокой вязкостью раствора, обусловленного высоким содержанием липидов, 0,1 0,15 г/г белка.
Целью изобретения является повышение чистоты ЦП за счет освобождения от высокомолекулярных примесей. Это достигается тем, что при осуществлении способа полученный после хроматографии элюат диафильтрацией или разведением переводят в условия, необходимые для выпадения высокомолекулярных примесей в осадок: концентрация белка 0,5 2% ионная сила 0,01 0,04 М, pH 5,1 5,4, и подвергают отстаиванию в течение 6 12 ч. Затем раствор центрифугируют и концентрируют ультрафильтрацией.
Сравнительный анализ заявляемого способа с прототипом показывает, что общими признаками у них являются: экстракция ЦП из исходного сырья (осадок Б, сыворотка крови), сорбция на анионообменнике с последующей элюцией и очистка целевого продукта. Отличительной особенностью заявляемого способа является замена стадии кристаллизации ЦП на отстаивании раствора ЦП при низкой концентрации белка (до 2%) и условиях, способствующих выпадению в осадок высокомолекулярных примесей (pH 5,1 -5,4, ионная сила ацетатного буфера 0,01 -0,04).
Недостатки использования кристаллизации для получения целевого продукта: необходимость высокой концентрации белка в растворе (7 13%), что влечет за собой соосаждение высокомолекулярных примесей, а также агрегация ЦП и низкий выход за счет остаточной концентрации ЦП в растворе.
Заявляемый способ обеспечивает осаждение из раствора церулоплазмина высокомолекулярных примесей, а в способе-прототипе происходит перевод церулоплазмина в нерастворимое состояние (кристаллизация), что сопровождается денатурацией белка и вышеуказанными недостатками, т.е. в заявляемом способе белок-церулоплазмин находится только в растворимом состоянии, что способствует сохранению нативности целевого продукта и повышению его выхода и чистоты. Указанные отличия в литературе не описаны.
Пример 1.
Исходное сырье осадок Б (III).
1 кг осадка III гомогенизируют в 1 л холодного 0,3 М АБ pH 5,5 затем приливают 5 л дистиллированной воды (2 -4oC), перемешивают в течение 30 мин и оставляют на 2 8 ч. Полученный раствор подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 30 мин. Осадок не используется. В центрифугат заливают ДЭАЭ сефадекс А-50 в АБ 0,05 М pH 5,5 из расчета 2 5 г на 1 кг осадка Б (60 150 мл). Перемешивают на настольной мешалке (МИ-2) с минимальной скоростью 4 6 ч. Отстаивают 1 ч и декантируют. Анионообменник (АО) перегружают в батист на воронке и отмывают 1,5 л 0,05 М АБ pH 5,5 с 0,07 М хлористого натрия. Перегружают АО в колонку и элюируют градиентом 0,05 0,3 М хлористого натрия в 0,05 М АБ pH 7,0. Получают 200 мл элюата с концентрацией белка 1% который подвергают диафильтрации на полых волокнах (ВПУ-15) четырьмя объемами 0,01 М АБ pH 5,4. Полученный раствор отстаивают 6 ч и центрифугируют. К центрифугату добавляют равный объем стабилизатора 5% раствора глюкозы pH 6,5 -7,5 и ведут диафильтрацию тремя объемами 5% раствора глюкозы с pH 6,0 7,0.
Выход 70% Специфическая оксидазная активность 30 ед. акт/мг белка. Чистота E610/E280= 0,042 (95%).
Пример 2.
Исходное сырье сыворотка.
Плацентарную сыворотку 0,5 л разбавляют 1,5 л 0,05 М АБ pH 5,5, температура 2 5oC. Выстаивают 10 16 ч и центрифугируют при 3000 об/мин 30 мин. Все дальнейшие процессы ведут при температуре 2 5oC. Осадок выбрасывают, а центрифугат, освобожденный от липопротеидов, забивающих колонку, наносят на колонку с ДЭАЭ сефадексом А-50 (2 4 г на 1 л исходной сыворотки) и отмывают 0,05 М АБ pH 7,0, содержащим 0,07 М хлористого натрия. ЦП элюируют градиентом хлористого натрия 0,07 0,3 М в АБ pH 0,05 М. Фракции с чистотой более 40 50% объединяют, подвергают диафильтрации против 3 объемов 0,025 М АБ pH 5,25 и концентрируют до 2% белка. Затем раствор подвергают выстаиванию 6 13 ч и центрифугированию. Белый осадок отбрасывают, а голубой раствор ЦП подвергают диафильтрации против 0,02 М АБ pH 6,0, содержащего 3,4% глюкозы.
Выход 80% Специфическая оксидазная активность 35 ед. акт/мг белка. Чистота E610/E280 0,045 (99%).
Пример 3.
Выделение ЦП из плацентарной сыворотки проводят как в примере 2 с тем отличием, что полученный после хроматографии элюат разводят холодной дистиллированной водой (2 6oC) до концентрации белка 0,5% и ионной силы 0,04 М, подкисляют 0,1 М ацетатным буфером (pH 3) до 5,1. Полученный раствор подвергают выстаиванию в течение 6 12 ч. Далее процесс ведут как в примере 2.
Характеристика полученного продукта: выход 74% специфическая оксидазная активность 33 ед. акт/мг белка, чистота E610/E280=0,043 (96%).
Обоснование найденных параметров способа.
Примеры 1 3 иллюстрируют достижение положительного эффекта в пределах выбранных значений параметра способа. Использование ионной силы меньше 0,01 и (или) pH ниже 5,1 приводит к денатурации белка с потерей синей окраски церулоплазмина. Ионная сила больше 0,04 и (или) pH 5,4 приводят к неполному освобождению от высокомолекулярных примесей.
Использование специальной стадии очистки для удаления высокомолекулярных примесей (липидов и аггрегатов) позволило получить ЦП с высокой степенью очистки, о чем свидетельствуют данные гель-хроматографии (фиг.1).
Гель-хроматография на сефадексе Г-200 (Фармация-ЛКБ, Швеция) церулоплазмина, полученного без ( а -прототип) и со стадией очистки от ЛП и аггрегатов (б заявляемый способ).
По данным гель-хроматографии видно, что высокомолекулярные примеси отсутствуют в препарате, полученном по предлагаемому способу, в то время как в препарате, полученном по способу-прототипу, их содержание составило 10 -20%
Содержание липопротеидов в процессе выделения ЦП представлено в табл.1.
Содержание липопротеидов в процессе выделения ЦП представлено в табл.1.
Содержание липопротеидов в сыворотке крови и в образцах определялось сульфофосфованилиновым методом [5]
Сравнительная характеристика ЦП, полученного различными способами, представлена в табл.2.
Сравнительная характеристика ЦП, полученного различными способами, представлена в табл.2.
Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение церулоплазмина, свободного от высокомолекулярных примесей, о чем свидетельствуют данные чистоты (95 99%) и гель-хроматографии.
Способ исключает воздействие на церулоплазмин денатурирующих факторов (этанол, высокая температура, кристаллизация-перевод в нерастворимое состояние), что предохраняет его от модификации биологических свойств и агрегации. Способ технологичен и не требует сложного оборудования.
Использованные источники информации
1. Авторское свидетельство СССР N 1003417, кл.A 61 K 35/16.
1. Авторское свидетельство СССР N 1003417, кл.A 61 K 35/16.
2. Авторское свидетельство СССР N 856078, кл.A 61 K 37/02 прототип.
3. Василец И.М. Шавловский М.М. Муха Г.Р. Физико-химические свойства и гетерогенность церулоплазмина крыс. Биохимия, 1970, 6, т. 35, вып. 6, с. 1139 1145.
4. Мхеян Э.Е. Влияние сывороточных белков на агрегацию тромбоцитов и эритроцитов. "Патологическая физиология и экспериментальная терапия", 1982, N 1, с. 23 24.
5. "Определение общих липидов в сыворотке крови по цветной реакции с сульфофосфованилиновым реактивом". В кн. под ред. Колб В.Г. Камышников В.С. "Справочник по клинической химии", 1976.
Claims (1)
- Способ получения церулоплазмина путем растворения исходного сырья в буферном растворе, сорбции фермента на ионообменнике, элюции и последующей очистки, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты фермента, полученный после хроматографии элюат с концентрацией белка 0,5 2,0% подвергают отстаиванию в течение 6 12 ч при рН 5,1 5,4 и ионной силе 0,01 0,04 центрифугированию и концентрируют ультрафильтрацией.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5012277/14A RU2087150C1 (ru) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | Способ получения церулоплазмина |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5012277/14A RU2087150C1 (ru) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | Способ получения церулоплазмина |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2087150C1 true RU2087150C1 (ru) | 1997-08-20 |
Family
ID=21589383
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5012277/14A RU2087150C1 (ru) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | Способ получения церулоплазмина |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2087150C1 (ru) |
-
1991
- 1991-08-23 RU SU5012277/14A patent/RU2087150C1/ru active IP Right Revival
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Авторское свидетельство СССР N 856078, кл. A 61 K 37/02, 1981. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US3992367A (en) | Process for the preparation of purified albumin by thermocoagulation and albumin obtained by said process | |
Pardee et al. | [18] Purification of muscle actin | |
FI85027B (fi) | Foerfarande foer extrahering av ett protein som utgoers av hepatit b -ytantigen eller alfa-1-antitrypsin ur supernatant och rening av detta protein. | |
Hartwig et al. | Isolation and properties of actin, myosin, and a new actinbinding protein in rabbit alveolar macrophages. | |
Egelrud et al. | The purification of a lipoprotein lipase from bovine skim milk | |
US3931399A (en) | Process for isolating a fibrin-stabilizing factor | |
Seckler et al. | Interactions of tubulin with guanylyl-(beta-gamma-methylene) diphosphonate. Formation and assembly of a stoichiometric complex. | |
US3389133A (en) | Process for isolating and purifying soluble ribonucleic acid | |
US4191533A (en) | Pregnancy-specific β1 -glycoprotein and process for isolating it | |
IE43449B1 (en) | Process reducing the anticomplementary activity of gamma globulins | |
CA1234047A (en) | Process for preparing the principal proteins of haemolyzed blood in the non-denatured form | |
EP0082587B1 (en) | Preparation of storage-stable serum | |
US3904751A (en) | Process for isolating a fibrin stabilizing factor from human placenta | |
JPH05279396A (ja) | 第viii因子の精製法と、それによって得られた調製品 | |
RU2087150C1 (ru) | Способ получения церулоплазмина | |
JPS6193128A (ja) | 遺伝子工学で処理した微生物から精製成長ホルモンを回収する方法 | |
US3905870A (en) | Purification of kallikrein | |
US3993585A (en) | Elevated human lipids control | |
CN108676784B (zh) | 一种牛乳中乳过氧化物酶的纯化方法 | |
US4588685A (en) | Process for the preparation of a new-type active substance selectively inhibiting food intake | |
US4169829A (en) | Process for the preparation of purified albumin and albumin obtained by said process | |
US4342748A (en) | Sleep-promoting factor | |
US4169139A (en) | Glyco/proteinaceous materials derivable from beef liver and other tissues useful for the treatment of toxic and allergic conditions | |
Morrison et al. | The isolation of cytochrome c by salt extraction | |
RU2026864C1 (ru) | Способ выделения днк |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
NF4A | Reinstatement of patent |