CS234607B1 - SpSsob stanovenia aktivity endo-1,4- β-xylanáz - Google Patents

Description

1 234 607

Vynález sa týká spósobu stanovenla aktivity endo-1,4--xylanáz (EC 3.2.1.8). Běžné metody testovania aktivity mikrobiálnych endo-1,4-£ --xylanáz sú založené na kvantitativnou» stanoveni redukujúcich sa ·charidov uvolněných z rastlinných xylanov pósobenim enzýmovýchpreparátov, Tieto metody neumožňujú selektivně stanovenie akti-vity éndo-1,4-(1-xylanáz v přítomnosti β-xylozidáz (exo--xy-lanáz, EC 3.2,Ϊ.37), ktoré prispievajú k tvorbě redukujúcich sa-charidov tým, že hydrolyzujú xylooligosacharidy na xylózu, Tie-to metody nie sú tiež vhodné na stanovenie aktivity endo-1,4--(L-xylanáz v roztokoch s vysokou koncentráciou redukujúcichsacharidov, ktoré je nutné odstraňovat dialýzou. Alternativněpostupy stanovenia aktivity endo-1,4--xylanáz využivajú mera-nie poklesu viskozity roztokov polymórnych substrátov, ako jenapr. karboxymetylxylan. Viskozimetrickú metodu možno označitazda za najcitlivejšiu a přitom velmi špecifickú metodu stanove-nia aktivity endo-1,4- (b-xylanáz, vyznačuje sa však zdlhavosťoumerani, preto nie je vhodná na analýzu váčšich sérii vzoriek. V posledných dvoch desaťročiach sa zavádzajú na stanovenie akti-vity róznych druhov endoglykanáz tzv. chromogénne substráty, od-povedajúce polysacharidy s kovalentne naviazaným farbivom CO, A.Stamm; Helv, Chira. Acta 46, 3008 (1963); P. Hagen, E. T. Reese, 0, A. Stamm; Helv, Chim, Acta 49, 2278 (1966); M. Leisola, M.Linko: Anal Biochem, 70, 592 (1976)3. Vo všetkých pripadoch sapoužívá ako substrát farebný polysacharid nerozpustný vo voděa v pufroch. Za mieru aktivity enzýmov sa považuje potom množ-stvo farbiva uvolněného do roztoku vo formě rozpustných frag-mentov polysacharidu s kovalentne viazaným farbivom. Na tomtoprincipe bol navrhnutý i spósob stanovenia aktivity endo-1,4-- Λ-xylanáz na xylanovom géli s kovalentne naviazaným farbivom, 2 234 807 ktorého nerozpustnost vo vodě sa dosiahla zosieťovanim vyfar-beného polysacharidu epichlórhydrinom CČs. AO 192 202], Použi-tie nerozpustných polysacharidov alebo ich derivátov s kova-lentne naviazaným farbivom ako substrátov na stanovenie akti-vity polysácharid hydroláz s endo-spósobom ataku substrátu u-možňuje sledovat enzýmovú reakciu vizuálně na základe přechodufarbiva do póvodne bezfarebného roztoku (filtrátu alebo supernatantu). Tento spósob sledovania enzýmovej reakcie ša dá uplat-nit vtedy ak sa enzýmová reakcia uskutočňuje v objemoch váč-šich ako je napúčací objem substrátu v inkubačnej zmesi. V ta-komto případe je však potřebné reakčné zmesi miešať, aby sa za-ručila rovnaká pravděpodobnost vytvárania enzým-substrátovéhokomplexu v celom objeme. 3e známe, že pri stanovení aktivity celuláz na farbenú mikrokryštalickú celulózu je množstvo uvolně-ného farbiva závislé od miešania zmesi £M. Leisola, M. Linko:Biochemical Laboratory Report 13, Technical Research Centreof Finland, Helsinki (1976)]. Pri analýze velkých sérií vzo-riek je požiadavka na miešanie nevýhodou, ktorú odstraňuje po-užitie farebnóho polysacharidového substrátu, ktorý je vo voděa v pufroch dokonale rozpustný a ktorý sa však dá z vodnéhoroztoku kvantitativné vyzrážať organickým rozpúšťadlom za pod-mienok, kedy kratšie farebnó fragmenty polysacharidu uvolněnéúčinkom enzýmu zostávajú v roztoku. Na tomto principe bolanavrhnutá metoda stanovenia aktivity endopektinázy (endopoly-galakturonanázy, EC 3.2.1.15) D. R. Friend, G. W. 3. Chang: □. Agr. Food Chem. 30, 892 (1982) , pri ktorej sa meria rý-chlosť uvolňovania farebných fragmentov z farbeného pektinu,ktoré sú rozpustné v 63 % etylalkohole.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že 4-0-metyl-D-glukoro-no-D-xylan so 4 až 20 % kovalentne naviazanej dvojsodnej soli l-amino-2-sulfo-4-O-(2-sulfátoetylsulfonylanilino)] antra-chinónu sa rozpustí v pufri o pH 4,0 až 6,0 v koncentrácii0,2 až 2,0 % hmot. pri teplote 50 až 90 °C a tento roztok sapo ochladení na 20 až 50 °C použije ako substrát do zmesi sroztokom endo-1,4- fl -xylanáz, v ktorých sa enzýmová reakciaprebiehajúca pri teplote 20 až 50 °C po dobu 5 až 180 minzastavuje přidáním dvoch objemov etylalkoholu, čím sa vyzrá-ža podiel nehydrolyzovaného substrátu, ktorý sa takto oddělíod rozpustných farebných fragmentov uvolněných účinkom enzý- - 3 - 234 607 mu, ktorých množstvo je úměrné koncentrácii enzýmu v zmesi atrvaniu inkubácie a ktoré sa stanovia fotometricky pri 580 až610 nm· Výhodou navrhovaného spfisobu stanovenia aktivity endo--1,4- fi, -xylanáz je, že využiva chromogénny substrát rozpuštěnývo vodě a v pufroch, čo zaručuje homogénne zloženie enzýmovýchinkubačných zmesi a odstraňuje požiadavky na miešanie, ako jetomu v případe nerozpustných chromogénnych substrátov a že en-zýmová reakcia sa zastavuje velmi jednoducho přidáním dvoch o-bjemov denaturovaného etylalkoholu, čo vedie k vyzrážaniu sub-strátu s výnimkou farebných fragmentov uvolněných účinkom en-zýmu z pdvodne úplné zrážatelného substrátu, Ďalšou výhodouje, že test je špecifický pře endo-1,4-β-xylanázy a je ibamálo ovplyvnitelný prítoranosťou β-xylozidáz (exo- (fe -xylanáz),že umožňuje stanoviť aktivitu endo-1,4- {λ-xylanáz v přítomno-sti redukujúcich sacharidov a iných redukujúcich látok ak tie-to nemajú inhibičný účinok na enzým a že je vhodný pre analý-zu velkého počtu vzoriek získaných napr, po frakcionáciibielkovin na kolonách chromatografiou, chromátofokusáciou, prípadne elektroforézou. Přiklad 1

Xylan obsahujúci 4,8 % kovalentne viazanej dvojsodnej so-li l-amino-2-sulfo-4-í 3-(2-sulfátoetylsulfonylanilino)3 an-trachinónu sa rozpustí v 0,05 mol.l” acetátovom pufri (zlo-ženia: kyselina octová a octan sódny), pH 5,4, za zahrievaniana teplotu 60 °C a miešania tak, aby 1 ml roztoku obsahoval5 mg modifikovaného polysacharidu. Po ochladení na teplotu40 °C sa 1 ml alikvóty miešajú s 0,1 ml objemami roztokuendo-1,4-p -xylanázy· Zmesi sa po premiešaní inkubujú pri te-plotě 40 °C po dobu 10 až 180 min. Reakcia sa zastaví přidá-ním dvoch objemov etylalkoholu (2,2 ml). Po dókladnom pre-miešaní sa zmesi nechajú stáť pri teplote 20 až 25 °C po do-bu 30 min, premiešajú sa a centrifugujú. Absorbancia čirýchsupernatantov sa meria oproti vzorke neobsahujúcej enzým pri580 nm. Farebná intenzita supernatantov je úměrná množstvuenzýmu v inkubačnej zmesi a trvaniu inkubácie. Za jednotku en-zým ověj aktivity sa považuje také množstvo fb-xylanázy, ktoréuvolni zo substrátu přítomného v inkubačnej zmesi za 1 min 4 234 607 fragmenty xylanu rozpuštěné v zmesi etylalkoholu a voda v objemovom pomere 2:1, ktoré obsahujú 1 % z celkového množ- stva farbiva dvojsodnej soli l-amino-2-sulfo-4- ££->(2-sulfáto- etylsulfonylanilino) ] antrachinónu viazaného na polymérny substrát. Příklad 2 0,3 ml objemy roztoku 5 mg xylanu s 13,6 % kovalentneviazaného farbiva dvojsodnej soli l-amino-2-sulfo-4-fJ-(2- * .a -sulfátoetylsulfonylanilino) } antrachinónu v 0,1 mol .1“ ci-trátovom pufri (zloženia: kyselina citrónová a citrát sódny)pH 4,8, sa miešajú s 0,2 ml objemami roztoku endo-l,4-£ -xy-lanázy. Po inkubácii při teplote 30 °C po dobu 5 až 180 minsa reakcia zastavuje přidáním 1 ml 96 % obj. etylalkoholu. Podókladnom premiešaní sa zmesi nechajú stáť po dobu 10 min priteplote 25 °C, premiešajú sa znovu a zrazenina sa centrifugu-je. Supernatanty sa fotometrujú pri 595 nm oproti supernatantuzískanému po zrážaní zmesi neobsahujúcej enzým. Přiklad 3

Xylan obsahujúci 18,0 % kovalentne viazaného farbivadvojsodnej soli l-amino-2-sulfo-4-[£-(2-sulfátoetylsulfonyla-nilino)3 antrachinónu sa rozpustí v 0,05 mol.l acetátovompufri, pH 5,4 v koncentrácii 0,4 % hmot. K 0,5 ml objemom toh-to roztoku sa pridajú 5 až 50 ^ul objemy roztoku endo-l,4-{i--xylanázy, zmesi sa premiešajú a inkubujú pri teplote 40 °Cpo dobu 5 až 180 min. Po zastaveni reakcií přidáním 1 ml96 % obj. etylalkoholu sa postupuje óalej ako v příklade 2.

Vynález má použitie v biochémii pri charakterizácii enzý-mových preparátov a stanovení aktivity endo-1,4--xylanáz.

Claims (1)

1. 5 PREDMET VYNÁLEZU 234 807 Spčsob stanovenia aktivity endo-1,4-β -xylanáz vyznačenýtým, že 4-0-metyl-D-glukurono-D-xylan obsahujúci 4 až 20 % ko-valentne viazaného farbiva dvojsodnej soli l-amino-2-sulfo-4~-[^-(2-sulfátoetylsulfonylanilino)J antrachinónu sa rozpustív koncentrácii 0,2 až 2,0 % hmot. pri teplote 50 až 90 °C vovodě'alebo v pufri o pH 4 až 6 a inkubuje sa v objeme 0,5 až2,0 ml s roztokom endo-1,4-^-xylanázy pri 20 až 50 °C po dobu5 až 180 min, kedy sa enzýmová reakcia zastaví přidáním dvochobjemov etylalkoholu, čím sa vyzráža·nehydrolyzovaný podielsubstrátu, ktorý sa takto oddělí od rozpustných farebnýchfragmentov uvolněných účinkom enzýmu, ktorých množstvo je úměr-né koncentrácii enzýmu v reakčnej zmesi a trvaniu inkubáciea ktoré sa stanovia fotometricky pri 580 až 610 nm.