CS233279B1 - Sposob pripravy subjednotkovéj vakcíny proti klieštovej encefalitidě - Google Patents

Abstract

Vynález sa týká sposobu pripravy subjednotkovéj vakcíny ku klieštovej encefalitidě. Podstatou vynálezu je, že· termosenzitívny kmen virusu klieštovej encefalitidy Skalica Cl. gl. 53 sa pomnožuje na tkanivových kulturách kuřácích embryonálnych buniek, virus sa semipurifikuje diferenciálnou centrifugáciou, sediment se resuspenduje do fyziologického roztoku,, štiepi sa tri krát éterom, ktorý sa odstráni, vakcína sa lyofilizuje. Vynález ma použitie v humánně j a veterinárnej praxi.

Description

233 279

Vynález sa týká sposobu*přípravy subjednotkovej vakcínyproti kliešťovej encefalitidě. E. N. Levkovič a tiež Ch. Kunz připravili inaktivovaněvakcíny proti kliešťovej encefalitidě na kuřácích embryonál-nych buňkách s následnou inaktiváciou formaldehydom> /5. N.levkovič: Biology of the tick-borne encephalitis complex.Czechoslovak Acad. Sci. 317 (1962); Ch. Kunz: Arzneim. Porsch.Drug. Res. 28, 10, 1806, (1978)J. Nevýhodou inaktivovánýchvakcín je ich příprava s plné virulentným kmenom virusu klieš-tovej encefalitidy. Mayer a Mitrová připravili živú atenuovanúvakcínu s kmenom Langat /Mayer a Mitrová: Biological works.Slovák Acad. Sci. Bratislava, (1977)J· Nevýhodou atenuovanejvakcíny je, že kmen Langat revertoval a nemóže sa použitk prípravé živej očkovacej látky.

Uvedené nevýhody v podstatnéj miere odstraňuje spósob pří-pravy subjednotkovej vakcíny proti kliešťovej encefalitidě, kto-rého podstata spočívá v tom, že termosenzitívny kmen virusukliešťovej encefalitidy -Cl. gl. 53? sa pomnožuje na tkanivovýchkultúrach kuřácích embryonálnych buniek; virus sa semipurifiku-je diferenciálnou centrifugáciou, resuspenduje do fyziologic-kého roztoku,, štiepi sa 3 krát éterom, ktorý sa odstráni, vak-cína sa vyČíri a lyofilizuje. Výhoda navrhovaného spósobu přípravy subjednotkovej vakcí- - 2 - 233 279 ny je, že sa pracuje s termosenzitívnym kmeňom virusu kliešťovejencefalitidy, ktorý je nepatogenný po podkožnom podáni bielymdospělým myšiam, co je významné z hlad!ska bezpečnosti pri práci.

I

Vakcína obsahuje subjednotky virusu, ktoré indukujú tvorbu pro-tilátok a je zbavená balastných látok. Tento sposob přípravy jeekonomicky nenáročný. Vakcínu možno skladovat po lyofilizácii. Příklad 1

Pripravujú sa tkanivové kultúry z 11 dňových C/E kuřácíchembryí, z ktorých sa odstránia oči a vnútornosti. Tkanivové kul-túry sa kultivujú v bazálnom Eaglovom médiu (BEM) s prímesou5 % fetálneho telacieho séra a antibiotik (penicilín a strepto-mycín). Po 24 hodinovéj kultivácii sa médium odstráni a tkanivo-vé kultúry sa infikujú vírusom kliešťovej encefalitidy (kmenSkalica, ktorý je uložený v čs. zbierke arbovírusov Virologic-kého ústavu SAV pod číslom Cl. gl. 53) so 7,5 log ΒΏ^θ/Ο,ΟΙ ml.Adsorbcia prebieha po dobu 90 min pri teplote 37 °C. Potom sapřidá čerstvé BEM s prímesou 5 % inaktivovaného séra a antibio-tik. Na prvý den sa médium stiahne a vyčíri. Purifikácia virususa robí diferenciálnou centrifugáciou pri 25.000 ot. za min.po dobu 2 h. Odstráni sa supernatant a sediment sa resuspendujedo 100 krát menšieho objemu izotonického fyziologického roztokuo pH 7,2 s prímesou 50yug gentamycínu na 1 ml. Po vyčírení saurčuje titer virusu pomocou hemaglutinačného testu. Preparát saza stálého miešania 3 krát štiepi éterom, 1 krát počas 5 min,druhý krát rovnakým dielom počas 18 h pri teplote 4 °C, 3 krátpočas 5 min. Po vyčírení sa éter odsaje, zbytky éteru sa odstrá-nia dusíkom. Vakcína sa lyofilizuje a skladuje pri teplote-20 °C. Skúšky neškodnosti vakcíny sa robia intracerebrálnou - 3 ” 233 279 inokuláciou očkovacej látky po 0,1 ml úalšej skupině bielych my-ší. Poéas pozorovacej doby 14 dní sa u žiadneho z pokusných zvie-rat neohjavilo poškodenie zdravotného stavu, ktoré by súviselos aplikáciou skúšaného preparátu. Skúška na nepřítomnost živéhovirusu sa robí na 5 až 8 g bielych myšiach. Myšiam sa inokulujepo 0,03 ml Intracerebrálne vakcíny neriedenej a Salšej skupiněmyší sa inokuluje po 0,03 ml vakcína riedená 1:10. Po 7 dnoch saodoberie od poloviny myší mozog na Salšiu pasáž· Celkove sarobia 2 pasáže. Sledovanie tvorby protilátok sa robí na 15 gmyšiach, kto:rým sa podá intraperitoneálne vakcína po 0,1 ml, 7 dní po prvej dávke sa odoberie od myší krv a sérum sa vyšetřu-je v hemaglutinašno-inhiblšnom teste. Druhá dávka vakcíny sa podápo 1 mesiaci. 7 dní po prvej vakcinácii sa vyšetřuje sérum myšína přítomnost hemaglutinačno-inhibičných protilátok. Ochrannýtest sa robí na dospělých bielych myšiach, ktoré sa imunizujújednou dávkou vakcíny intraperitoneálne po 0,1 ml. Po 7 až 8dnoch sa robí challenge živým vírusom. Myši sú chráněné proti100 LD^q (myšie smrtelné dávky) virusu. Skúška sterility vak-oíny sa robí podlá Sel. 3. Příklad 2

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa viruskultivuje prJL 37‘ °C počas 48 h. Příklad 3

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa viru-sové partikule separujú v sacharózovom gradiente hustoty(10 až 30 % saúharóza/. Příklad. 4 233 271

Poetupuje aa ako v příklade 1 a tým rozdielom, že finálnypreparát pe extrakeii éterem ea opracuje formalínom v konešnomriedení 1:2 000, udržuje ea po dobu 3 dni pri teploto 4 °G,formalín ea odetránll tak, že k 100 ml vzorky ea přidalo 1,7 ml5 % pyroeirižitana eodného. Po zmiešaní ea vzorka naplní do dialyzaéného eáška a tento ea dialyzuje v 3. litroch fyziologické-ho roztoku pri teploto 4 °0 po dobu 20 hodin. Vakoína ea po dialýze lyofilizuje·

Vynález mdže nájst široké použiti® v médieíne, ako vakoínaproti vírueu klieštovej encefalitidy.

Claims (1)

1. PREDMET VYNÁLEZU 233 279 Spósob přípravy subjednotkove^ takcíny proti kliešfovejencefalitida vyznačujúci sa tým, že termosenzitívny kmen,virusklieštovej encefalitidy Cl. gl. 53 Skalice sa pomnožuje natkanivových kultúrach kuřácích embryonálnych buniek, virus sasemipurifikuje diferenciálnou centrifugáciou, resuspenduje do fyziologického roztoku, štiepi sa 3 krát éterom, ktorý sa i odstráni, vakcína sa vyčíri a lyofilizuje.