CS233233B1 - Spósob přípravy (U-’4C) manózo-6-fosfátu - Google Patents

Abstract

Vynález sa týká oboru biochémie, chámie sacharidov, ako aj lekárskej a potravinářskéj chemie. Vynález rleSi přípravu (U-C) manozofosfátu pre Stádium metabolizmu sacharidov, ako aj pre teoretická Štúdie v oblasti chéale a biochémie sacharidov. Uvedeného účelu sa dosiahne tým, Se na roztok (U-,4C)glukázo-6-fosfátu, připraveného z vodorozpustného alfa (1-> 4,6) glukánu so zelených alebo modrozelených rias, připraveného podía čs. AO 211 785 sa pósobí pufrovaným rostokom fosfomanozo izomerázy pri pH 7,2a vzniknutý produkt sa izoluje chromatografion na papieri.

Description

233233 2

Vynález sa týká spísobu přípravy (U-’^C) mano'zo-6-fosfátu následným účinkom enzýmumanóza fosfát izomerázy (D-manóza-6-fosfát ketol izomeráza, EC 5.3.1.8) na (U-'^C) fruktó-zo-6-fosfát, připravený podl’a čs. AO 211 785 o vysekej mólovej aktivitě. Příprava (U-’^C) manózo-6-fosfátu nie je v literatúre popisovaná. Vhodným zdrojomcukrov značených rádionuklidom je alfa (1-*4,6) glukán, izolovaný z rádioaktívnehobiologického materiálu, s výhodou z rias, v procese komplexného spracovania rádioaktívnejbiomasy (čs. pat. 121 808), Následným účinkom enzýmov fosforylázy (alfa-1,4-glukan : orto-fosfát alfa-glukozyltransferéza, EC 2.4.1.1.), fosfoglukomutázy (alfa-D-glukózo-1,6--difosfát : alfa-D-glukózo-1-fosfát fosfotransferáza, EC 2.7.5.1.) glukózofosfát izomerázy(D-glukSizo-6-fosfát ketol izomeráza, EC 5.3.1.9) na (1—*4,6) glukán značený rádionuklidom14C možno pripraviť po chromatografickej separácii (U-'^C) fruktózo-6-fosfát, ako východziulátku k přípravě JalSích fosforyltfvaných derivátov cukrov. (U-1*C) D-manózo-6-fosfát možno připravit účinkom monokinázy (ATP : D-manózo 6-fosfo-transferáza, EC 2.7.1.7) na (U-’^C) D-manózu a ATP. Aj kej výtažok v tejto reakcii jevysoký, nevýhodou je, že sa spracováva vzácný cukor (U-'^C) D-manóza a nie východzí zdrojpre přípravu cukrov, vodorozpustný glukán. Táto nevýhoda je riežená postupom podTa vy-nálezu, kedy východzou látkou je priamo vodorozpustný polysacharid, připravený v rámcikomplexného spracovania rádioaktívnej biomasy (čs. pat. č. 121 808).

Podstata vynálezu spočívá v tom, že na vetvený polysacharid typu alfa (1—>4) glukánus větvením 1-^6 vazbami, izolovaný z rádi okatí vneho biologického materiálu, s výhodou sozelených, resp. modrozelených rias, v procese komplexného spracovania rádioaktívnej biomasysa písobí enzýmom fosforylázou (alfa-1,4-glukán ortofosfát glukozyltransferáza, EC 2.4.1.1)v přítomnosti pufrovaného roztoku fosfátu o pH 6 až 7 (čs. AO 194 587), pričom na získanýalfa-D-glukopyranozylfosfát (U-'^C) sa písobí pufrovaným roztokom fosfoglukomutázy v pří-tomnosti cysteinu, síranu horečnatého a glukózo-1,6-difosfátu (pH 7,5 až 8,0) a na získanýglukózo-6-fosfát (U-’^C) sa písobí pufrovaným roztokom glukozo-6-fosfát izomerázy pripH 9,0 a na vytvořený fruktózo-6-fosfát (U-'^C) (čs. AO 211 785) sa písobí enzýmom mano-zofosfát izomerázou v pufrovenom prostředí o pH 7,2 a vytvořený manózo-6-fosfát (U-'^C)sa oddělí chromatografiou na papieri. Vzhl’adom na D-alfa-glukopyranozylfosfát je výťažokmanózo-6-fosfátu (U-'^C) až 38 %. Výhodou navrhovaného postupu přípravy (U-’^C) značených fosforylovaných derivátovD-manózy je, že celý postup přípravy je velmi jednoduchý a vžetky enzýmy potřebné k pre>-vedeniu prísluSných realizácií sú komerčně dostupné, připadne pripraviteTné v laboratór-nych podmienkach. Příklad K 0,1 ml 1 % roztoku vodorozpustného polysacharidu (U-'Λ)) zo zelených rias o celkovejaktivitě 20 kBq sa přidal 1 ml 0,2 mol/1 fosfátového pufru o pH 6,0 a 1 ml fosforylázyzo zemiakov (AO 194 588) a reakčná zmes sa inkubovala pri 35 °C po dobu 4 hodin. Po pře-běhnutí reakcie sa nastavilo pH reakčnej zmesi na hodnotu 7,5 pomocou 0,5 mol/1 fosfátovéhopufru (pH 8,0) a přidal sa cystein na výsledná koncentréciu 50 mmol/1, síran horečnatý6 mmol/1 a glukózo-1-,6-difosfát na 0,1 mmol/1 a 10 ^/ul fosfoglukomutázy (z pekárenskýchkvasinlek/5 nkat) a reakčná zmes sa Inkubovala Jalžie 2 hodiny pri 35 °C.

Po ukončení reakcie s fosfoglukomutázou pH hodnota reakčnej zmesi sa nastavila napň 9,0 pomocou 0 5 mol/1 glycínhydroxid sodný tlmivého roztoku (pH ,0) a přidala sakvasničná glukozo-6-fosfét izomeráza (lOjul; 25 nkat) a inkubácia prebiehala Jalžiu ho-dinu pri 35 °C (čs. AO 211 785). Po ukončení reakcie s glukózo-6-fosfát izomerázou sareakčná zmes odpařila do sucha na vákuovej odparke pri 70 °C a přidal sa zriedený roztokkyseliny chlorovodíkovéj 0,1 mol/1 (cca 3 ml) až pokial’ výsledné pH roztoku bolo 7,2.Potom sa přidal enzým fosfomanóza izomeráza (10yul; 8 nkat) a reakcia prebiehala po dobu

Claims (1)

1. 3 233233 áalšej 1 hodiny při 30 °C. Po spracovaní reakínej zmesi sa aeparácia fosforylováných deri-vá>tov previedla v systéme kyselina izomaslová - čpavok - voda (66:1:32) papierovou Chro-matografiou po dobu 100 hodin. Manózo-6-fosfát (U-'^C) sa získal o výtažku 7,6 kBq (38 %). Fosforylované deriváty D-manozy sú ddležité biochemikálie, ktoré v značenom stave,ako (U-'^C) rádiochemikálie možno použit k štúdiu enzýmových procesov prebiehajúeichin vitro, akó aj k histochemickým štúdiam a k enzýmovej diagnostike metabolických poruch.Možno ich považovat aj za d61ežité východzie látky k chemickým syntézám v oblasti cukrov. PREDMIT VYNA^LEZU Spísob přípravy (U-'^C) manozo-6-fosfátu z rádioaktívneho biologického materiálu,s výhodou větveného vodorozpustného alfa (1->4,6) glukánu zo zelených alebo modrozelenýchrias, vyznačujúcl sa tým, že na roztok získaného (U-'^G) glukózo-6-fosfétu, sa pftsobípufrovaným roztokom fosfomanozo izomerázy pri pH 7,2 a vzniknutý produkt sa izolujechromatografiou na papieri.