233233 2233233 2
Vynález sa týká spísobu přípravy (U-’^C) mano'zo-6-fosfátu následným účinkom enzýmumanóza fosfát izomerázy (D-manóza-6-fosfát ketol izomeráza, EC 5.3.1.8) na (U-'^C) fruktó-zo-6-fosfát, připravený podl’a čs. AO 211 785 o vysekej mólovej aktivitě. Příprava (U-’^C) manózo-6-fosfátu nie je v literatúre popisovaná. Vhodným zdrojomcukrov značených rádionuklidom je alfa (1-*4,6) glukán, izolovaný z rádioaktívnehobiologického materiálu, s výhodou z rias, v procese komplexného spracovania rádioaktívnejbiomasy (čs. pat. 121 808), Následným účinkom enzýmov fosforylázy (alfa-1,4-glukan : orto-fosfát alfa-glukozyltransferéza, EC 2.4.1.1.), fosfoglukomutázy (alfa-D-glukózo-1,6--difosfát : alfa-D-glukózo-1-fosfát fosfotransferáza, EC 2.7.5.1.) glukózofosfát izomerázy(D-glukSizo-6-fosfát ketol izomeráza, EC 5.3.1.9) na (1—*4,6) glukán značený rádionuklidom14C možno pripraviť po chromatografickej separácii (U-'^C) fruktózo-6-fosfát, ako východziulátku k přípravě JalSích fosforyltfvaných derivátov cukrov. (U-1*C) D-manózo-6-fosfát možno připravit účinkom monokinázy (ATP : D-manózo 6-fosfo-transferáza, EC 2.7.1.7) na (U-’^C) D-manózu a ATP. Aj kej výtažok v tejto reakcii jevysoký, nevýhodou je, že sa spracováva vzácný cukor (U-'^C) D-manóza a nie východzí zdrojpre přípravu cukrov, vodorozpustný glukán. Táto nevýhoda je riežená postupom podTa vy-nálezu, kedy východzou látkou je priamo vodorozpustný polysacharid, připravený v rámcikomplexného spracovania rádioaktívnej biomasy (čs. pat. č. 121 808).BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to a process for the preparation of (U - ' C) mannose-6-phosphate by the subsequent action of enzyme humanose phosphate isomerase (D-mannose-6-phosphate ketol isomerase, EC 5.3.1.8) on z-6-phosphate, prepared by MS. AO 211 785 on high molar activity. The preparation of (U -? - C) mannose-6-phosphate is not described in the literature. A suitable radionuclide-labeled sugar source is alpha (1- * 4,6) glucan, isolated from radioactive biology material, preferably algae, in the process of complex radioactive biomass processing (No. 121 808), followed by the action of phosphorylase enzymes (alpha-1,4 -glucan: ortho-phosphate alpha-glucosyltransferesis, EC 2.4.1.1.), phosphoglucomutase (alpha-D-glucose-1,6-diphosphate: alpha-D-glucose-1-phosphate phosphotransferase, EC 2.7.5.1.) glucose phosphate isomerase (D-glucose-6-phosphate ketol isomerase, EC 5.3.1.9) on radionuclide labeled 14C (1 → 4,6) glucan after the chromatographic separation of (U -? - C) fructose-6-phosphate as starting point the preparation of Jalsi phosphorylated sugar derivatives. (U-1 * C) D-mannose-6-phosphate can be prepared by monokinase (ATP: D-mannose 6-phospho-transferase, EC 2.7.1.7) to (U -? - C) D-mannose and ATP. Although the yield in this reaction is high, the disadvantage is that the noble sugar (U -? - C) D-mannose is treated and not the water source of the sugar, water-soluble glucan. This disadvantage is solved by the process according to the invention, wherein the starting substance is a water-soluble polysaccharide, prepared in the framework of complex radioactive biomass processing (No. 121 808).
Podstata vynálezu spočívá v tom, že na vetvený polysacharid typu alfa (1—>4) glukánus větvením 1-^6 vazbami, izolovaný z rádi okatí vneho biologického materiálu, s výhodou sozelených, resp. modrozelených rias, v procese komplexného spracovania rádioaktívnej biomasysa písobí enzýmom fosforylázou (alfa-1,4-glukán ortofosfát glukozyltransferáza, EC 2.4.1.1)v přítomnosti pufrovaného roztoku fosfátu o pH 6 až 7 (čs. AO 194 587), pričom na získanýalfa-D-glukopyranozylfosfát (U-'^C) sa písobí pufrovaným roztokom fosfoglukomutázy v pří-tomnosti cysteinu, síranu horečnatého a glukózo-1,6-difosfátu (pH 7,5 až 8,0) a na získanýglukózo-6-fosfát (U-’^C) sa písobí pufrovaným roztokom glukozo-6-fosfát izomerázy pripH 9,0 a na vytvořený fruktózo-6-fosfát (U-'^C) (čs. AO 211 785) sa písobí enzýmom mano-zofosfát izomerázou v pufrovenom prostředí o pH 7,2 a vytvořený manózo-6-fosfát (U-'^C)sa oddělí chromatografiou na papieri. Vzhl’adom na D-alfa-glukopyranozylfosfát je výťažokmanózo-6-fosfátu (U-'^C) až 38 %. Výhodou navrhovaného postupu přípravy (U-’^C) značených fosforylovaných derivátovD-manózy je, že celý postup přípravy je velmi jednoduchý a vžetky enzýmy potřebné k pre>-vedeniu prísluSných realizácií sú komerčně dostupné, připadne pripraviteTné v laboratór-nych podmienkach. Příklad K 0,1 ml 1 % roztoku vodorozpustného polysacharidu (U-'Λ)) zo zelených rias o celkovejaktivitě 20 kBq sa přidal 1 ml 0,2 mol/1 fosfátového pufru o pH 6,0 a 1 ml fosforylázyzo zemiakov (AO 194 588) a reakčná zmes sa inkubovala pri 35 °C po dobu 4 hodin. Po pře-běhnutí reakcie sa nastavilo pH reakčnej zmesi na hodnotu 7,5 pomocou 0,5 mol/1 fosfátovéhopufru (pH 8,0) a přidal sa cystein na výsledná koncentréciu 50 mmol/1, síran horečnatý6 mmol/1 a glukózo-1-,6-difosfát na 0,1 mmol/1 a 10 ^/ul fosfoglukomutázy (z pekárenskýchkvasinlek/5 nkat) a reakčná zmes sa Inkubovala Jalžie 2 hodiny pri 35 °C.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is based on the fact that the branched polysaccharide of the alpha (1 → 4) glucan type is branched with 1-6 linkages, isolated from the boundary biological material, preferably green, respectively. blue-green algae, in the process of complex processing of radioactive biomasysa by the enzyme phosphorylase (alpha-1,4-glucan orthophosphate glucosyltransferase, EC 2.4.1.1) in the presence of a buffered phosphate solution of pH 6 to 7 (MS-AO 194 587), D-glucopyranosyl phosphate (U-C-C) is written in a buffered phosphoglucomutase solution in the presence of cysteine, magnesium sulfate and glucose-1,6-diphosphate (pH 7.5 to 8.0) and the obtained glucose-6-phosphate (U). C) is written with a buffered solution of glucoso-6-phosphate isomerase and 9,0, respectively, and the fructose-6-phosphate (U-CC) (MS AO 211 785) formed by the enzyme mannophosphate isomerase in buffered the pH 7.2 and the mannose-6-phosphate (U-CC) formed is separated by chromatography on paper. With respect to D-alpha-glucopyranosyl phosphate, the yield of mannose-6-phosphate (U -? C) is up to 38%. An advantage of the proposed process for the preparation of (U - (-) C) labeled phosphorylated D-mannose derivatives is that the whole process of preparation is very simple and all the enzymes needed to carry out the relevant embodiments are commercially available, optionally preparable under laboratory conditions. Example To 1 ml of a 1% solution of water-soluble polysaccharide (U-Λ)) from green algae with a total activity of 20 kBq was added 1 ml of 0.2 mol / l phosphate buffer pH 6.0 and 1 ml of phosphorous acid (AO 194) 588) and the reaction mixture was incubated at 35 ° C for 4 hours. After the reaction was over, the pH of the reaction mixture was adjusted to 7.5 with 0.5 mol / l phosphate buffer (pH 8.0) and cysteine was added to a final concentration of 50 mmol / l, magnesium sulphate 6 mmol / l and glucose-1. - 6-diphosphate to 0.1 mmol / l and 10 µl of phosphoglucomutase (from bakery yeasts / 5 ml) and incubate for one hour at 35 ° C.
Po ukončení reakcie s fosfoglukomutázou pH hodnota reakčnej zmesi sa nastavila napň 9,0 pomocou 0 5 mol/1 glycínhydroxid sodný tlmivého roztoku (pH ,0) a přidala sakvasničná glukozo-6-fosfét izomeráza (lOjul; 25 nkat) a inkubácia prebiehala Jalžiu ho-dinu pri 35 °C (čs. AO 211 785). Po ukončení reakcie s glukózo-6-fosfát izomerázou sareakčná zmes odpařila do sucha na vákuovej odparke pri 70 °C a přidal sa zriedený roztokkyseliny chlorovodíkovéj 0,1 mol/1 (cca 3 ml) až pokial’ výsledné pH roztoku bolo 7,2.Potom sa přidal enzým fosfomanóza izomeráza (10yul; 8 nkat) a reakcia prebiehala po dobuAfter the phosphoglucomutase reaction was complete, the pH of the reaction mixture was adjusted to 9.0 with 0.5 M glycine sodium hydroxide buffer (pH 0) and the saccharide glucose-6-phosphate isomerase (10 µl; 25 nkat) was added and incubation was carried out with Yale. -Dine at 35 ° C (MS AO 211 785). After completion of the reaction with glucose-6-phosphate isomerase, the reaction mixture was evaporated to dryness in a vacuum evaporator at 70 ° C and diluted with 0.1M hydrochloric acid (ca. 3 mL) until the pH of the solution was 7.2. Phosphomannose isomerase (10yul; 8 nkat) was then added and the reaction was run for