CS232642B1 - Sposob imobilizácie biopolymérov a buniek - Google Patents

Abstract

Vynález sa týká oboru biochémie, polymérnej chemie, mikrobiologie a biotechnologie. Vynález rieši sposob imobilizácie biopolymérov, predovšetkým proteinov peptidov, enzýmov a celých mikrobiálnych buniek. Uvedeného účelu sa dosiahne tým, že příslušné biopolymérne látky, resp. celé mikrobiálně buňky sa rozpustia alebo suspendujú v roztoku polyetylénimínu tak, aby koncentrácia polyetylénimínu bola v roztoku 15 až 25 % hmotnostných a koncentrácie biologicky aktívneho proteinu alebo mikrobiálnych buniek 0,25 až 5 % hmotnostných, načo sa homogenizovaný roztok alebo suspenzia zosieťuje bifunkčným sietovacím reagentom, najlepšie s 2-chlormetyloxiránom, 1,6-diizotiokyanátom hexanu, 1,6-diizokyanátom hexanu, gluteraldehydom alebo chloridom kyseliny glutarovej po dobu 10 až 60 minút pri teplote 10 až 30 °C. Vynález má využitie všade, kde je účelné imobilizovať biologicky aktivně látky, resp. celé buňky či už pre analytické, alebo priemyslové využitie.

Description

232642 Přihláška vynálezu sa týká sposobu imo-bilizácie biologicky aktívnych biopolymérov,predovšetkým proteinov, peptidov, enzýmova celých mikrobiálnych buniek.

Spósoby imobilizácie biologicky aktívnychbiopolymérov ako aj celých buniek sú po-vačšine viacstupňové procesy, pozostávajú-ce z přípravy a aktivácie matrice k imobili-zácii, adjustácie matrice pre vlastnú imobi-lizačnú reakciu a z odstránenia inezreago-vaných východzích látok a reakčných splo-dín. Nedostatkom vačšiny nosičov je poměr-ně nízký obsah funkčných skupin využitel-ných k imobilizácii, resp. ich nerovnoměrnádistribúcia. Uvedené nedostatky čiastočmeeliminuje využitie polyetylénimínu ako enzý-mového nosiče [E. Kuniak, J. Zemek: AO č.159,063; J. Zámocký, J. Zemek, E. Kuniak, S.Kučár: AO 198 554; J. Zemek, E. Kuniak, P.Gemeiner, J. Zámocký, Š. Kučár: EnzymeMicrob. Technol. 4, 233, (1982)], použité po-stupy sú však poměrně pracné, zosietenýskelet enzýmového nosiča neumožňuje vy-tvorenie membrány alebo filmu s imobilizo-vaným enzýmom a v případe, že by mali byťimobilizované celé buňky, výťažnosť imobili-začnej reakcie by bola velmi nízká.

Uvedené nedostatky rieši principiálně no-vý vynález, a to rozpuštěním alebo suspendo-váním imobilizovanej látky v roztoku poly-etylénimínu a masledovným zosietením uve-deného polyméru. Uvedené nevýhody v pod-statnej miere odstraňuje sposob imobilizáciebiopolymérov a buniek podlá vynálezu, kto-rého podstata spočívá v tom, že do 100 hmot-nostných dielov vodného roztoku polyety-lénimínu o koncentrácii 30 až 50 % hmotnost-ných sa přidá 100 hmotnostných dielov vod-ného roztoku alebo: suspenzie obsahujúce0,5 až 10 % hmotnostných biopolymérovalebo celých buniek a po zhomogenizovaníreakčnej zmesi sa přidá 5 až 20 hmotnost-ných dielov bifunkčného sieťovacieho rea-gentu ako 2-chlormetyloxiránu, 1,6-diizo-kyanátu hexanu, 1,6-diizotiokyanátu hexa-nu, glutaraldehydu alebo chloridu kyselinyglutarovej, pričom reakcia prebieha 10 až60 minut pri teplote 10 až 30 °C. Výhodou nového sposobu imobilizácie bio-polymérov a celých buniek je jeho jedno-duchost, nakoíko netřeba reakčnú zmes spe-ciálně upravovat, reakcia imobilizácie pre-bieha pri teplotách běžných v laboratóriáchpo krátku dobu, po skončení imobilizácienetřeba gél nosiča osobitne adjustovať. Na-kolko pri imobilizácii dochádza jednak kimobilizácii kovalentnou vazbou, jednak kenkapsulácii biopolymérov do vnútornejštruktúry nosiča v dosledku čoho je hmot-nostný podiel biopolymérov, resp. celýchbuniek v polyetylénovom nosiči velmi vyso-ký, až 30 % a tým aj vysoká účinnost imo-bilizácie. Nezanedbatelnou výhodou je ajnízká cena základného' polyméru.

Uvedený spósob imobilizácie nie je všakvyhovujúci pre tie biosystémy, ktoré sú v al- kalickom prostředí polyetylénimínu dezakti-vované (napr. pepsin). Příklad 1 2,25 g polyetylénimínu (0,02 mol) o kon-centrácii 40 % hmotnostných a strednej mo-lekulovej hmotnosti 40 000 sa zmieša s 2,25gramu suspenzie enzýmu glukózooxidázy(EC 1.1.3.4), obsahujúcej 0,0225 g enzýmové-h.0' glykolproteinu, 0,05 g albuminu hová-dzieho séra vo fosfátovom pufri (10,0 mmól//1; pH 7,8) a po dokládnom premiešaní naelektromagnetickej miešačke (10 min.) sapřidá 0,112 g 2-chlormetyloxiránu. Po 10minutách a pri teplote 30 °C sa ztuhlý gélmobilizovaného enzýmu dezintegruje v mi-xéri, premyje na filtr! so 100 ml destilova-nej vody a nechá sa vysušit. Výťažok pro-teinu pri imobilizácii 0,021 g, t. j. 93 °/o. Po-kles celkovej aktivity glukózooxidázy v prie-behu imobiliácie je z 0,2 jukat na 0,17,ukat. Příklad 2 19 g vodného roztoku polyetylénimínu okoncentrácii 10 % hmotnostných sa zmiešas 0,095 g suspenzie permeabilizovaných bu-niek Wingea robertsii s xylózoizomerázovouaktivitou (4/xkat/g biomasy) v 0,9 ml desti-lovanej vody. Po dokládnom premiešaní naelektromagnetickej miešačke sa přidá 1,8 g1,6-diizotiokyanátu hexanu a nechá sa rea-govat po dobu 15 minút pri teplote 10 °C.Po vysušení sa získá 3,1 g suchého gélu o:aktivitě xylózaizomerázy 90 nkat/g získané-ho gélu. P r í k 1 a d 3 Ták ako je uvedené v příklade 1 s tým roz-dielom, že sa vychádza z 5 g vodného rozto-ku polyetylénimínu a vlastná imobilizáciasa prevedie s 0,2 g 1,6-diizokyanátu hexanu,pri teplote 22 CC po dobu 12 minút. Poklesaktivity glukózooxidázy v priebehu imobili-zácie je z 0,2 ,ukat na 0,18 ,ukat. P r í k 1 a d 4

Tak ako je uvedené v příklade 1 s týmrozdielom, že sa vychádza v 10 g vodnéhoroztoku polyetylénimínu, přidá sa 2,5 g glu-kózooxidázy a po dókladnom premiešaní naelektromagnetickej miešačke sa přidá 0,2 gglutaraldehydu. Po 15 minutách a pri teplo-te 30 °C je reakcia skončená, pričom poklescelkovej aktivity glukózooxidázy je z 0,2^kat na 0,15 ^kat. Příklad 5

Tak ako je uvedené v příklade 4 s týmrozdielom, že namiesto glutaraldehydu sapoužije 0,2 g chloridu kyseliny glutaroveja namiesto glukózooxidázy sa použije ace-

Claims (1)

1. 232642 5 tylcholínesteráza (0,1 g EC 3.1.1.7) o špeci-fickej aktivitě nkat/mg. Pokles celkovej ak-tivity acetylcholínesterázy v priebehu imo-bilizácie bol za 7 ^kat na 5,94 ^kat, t. j. o15 %. Vynález má využitie všade, kde je potřeb-né imobilizovať biologicky aktivně látky,resp. celé buňky či už pře analytické, alebopriemyslové využitie. • PŘEĎME' Sposob imobilizácie biopolymérov a bu-t niek vyznačený tým, že do 100 hmotnost- ných dielov vodného roztoku polyetylénimí-nu o koncentrácii 30 až 50 % hmotnostnýchsa přidá 100 hmotnostných dielov vodnéhoroztoku alebo suspenzie obsahujúce 0,5 až10 °/o hmotnostných biopolymérov alebo ce-lých buniek a po zhomogenizovaní reakčnej VYNALEZU zmesi sa přidá 5 až 20 hmotnostných dielovbifunkčného sieťovacieho reagentu ako 2--chlormetyloxiránu, 1,6-diizokyanátu hexa-nu, 1,6-diizotiokyanát hexanu, glutaralde-hydu alebo chloridu kyseliny glutarovej, pri-čom reakcia prebieha 10 až 60 minút priteplote 10 až 30 °C.