CS232326B1 - Spdsob stanovenia koncentrácia bielkovín v biologických materiálech - Google Patents

Abstract

Vynález sa týká spOsobu stanovenia koncentrécie bielkovín v biologických materiáloch. PodTa vynálezu sa postupuje tak, že vhodné farbivo s výhodou Coomasie Blue G (C.I. 42655) sa rozpustí v metanole, pridajú sa kyseliny s výhodou kyselina chlórovodíkové, alebo kyselina chloristé, připadne kyselena fosforečné o koncentrácli 0,25 až 0,8 mol/1 a chlorid sodný na potlačenie adhézie na sklenné časti meracej kyvety. Do takto připraveného reakčného roztoku sa přidá roztok obsahujúci bielkovinu, ktoré spčsobuje posun absorpčného pásu a zvýšenie hodnoty absorbancie meraného roztoku. Zvýšenie absorbancie je úměrné koncentrácli prítomnej bielkoviny. Vynález má využitie predovšetkým v klinickej diagnostike pri stanovení bielkovín v rOznych tělových tekutinách, no a6že sa využit lv priemyslovej praxi pri medzioperačnej kontrole přípravy bielkovinových aubstrétov.

Description

232326 2 Přihláška vynálezu aa týká spfisobu stanoveni* koncentrácie bielkovín v biologickýchmateriálech ako v močí, likvore, krvnom sére a ňalšich tekutinách predovšetkýa v pod-nienkach základného a aplikovaného výskumu a v rutinněj analytickéj prevádzke. V doterajšej laboratórnej praxi sa pře stanovenle koncentrácie bielkovín používá kla-sická metoda podlá Lowryho s fenolovým Folinovým činidlom Bowry 0. H., Rosebrough N. J., ř’arrA. L., Randall R. J. i J. Eiol. Chem. 193 (1951) 265 pre vyššie koncentrácie běžná biureto-vá reakcia (Rose 1833) alebo podTa Extona (Reál lexikon der Medizin, Urban and Schwanzenberg,Munchen 1966, s. 206, E 274). V posledněj době sa objavil rad technik založených na tvorběfarebných komplexov medzi farbivom a bielkovinou Bradford Μ. M.: Analyt. Biochem. 72 (1976)248; Sedmak J. J., Grossberg S. E.: Analyt. Biochem. 79 (1977) 544; Spector T.: Analyt.Biochem. §6 (1978) 142.

Tieto metody stí založené na spektrofotometrickon stanovení koncentrácie farebnéhokomplexu farbiva s bielkovinou. Farbivo je v kyslom prostředí v oxidovanom stave, pri vzni-ku komplexu s proteinem sa farbivo redukuje pričom dochádza k posunu absorbančného maximaa k podstatnému nárastu v hodnotě absorbancis. Ako farbivo sa v súčasnosti využívá Coomasiebriliant blue G-250, ¢0 je identické s farbivom Serva Blue G (Color Index fi. 42655) a che-micky je to 3- [[N-etyl-N-/3-metyl-4-/4-(4-etoxyanilino)fenylJ - <2-metyl-4- {N-etyl-N-[3--(sódium sulfonáto)fenyl metyl]} aminofenyl>/metylén-2,5-cyklohexadién-1-ylidén/]] imónio-benzén sulfonát.

Oproti klasickým metodám použitie techniky tvorby farebného komplexu uvedeného farbi-va s bielkovinami má výhodu v rýchlosti převedením analýzy, nevýhoda je však vysoká adhezi-vita farbiva k stenám meracích kyviet. Vysoká citlivost’ metody sa projevuje ako výhodapri stanoveni v moči resp. likvore, kde stačí k analýze aj 10/jl vzorky, znemožňuje všaksúčasne analýzu vzoriek s vysokou koncentráciou proteinov (krvné sérum, plazma).

Uvedené nedostatky rieši spĎeob stanevenia koncentrácie bielkovín v biologických ma-teriálech a to jednak úpravou prostredia analyzovanej tekutiny, jednak modifikáciou štruk-túry farbiva.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že v prvom stupni sa připraví roztok 3-[TN-etyl-N--/3-metyl-4-/[4-(4-etoxyanllino)fenyl] -<2-metyl-4-{N-etyl-N-[3-( sódium sulfonáto)f enylmetyl]} aminoetyl]>/metylén-2,5 dimetyl-2,5 cyklohexadién-1-ylidén/]] imóniobenzénsulfo-nátu alebo 3-(£H“hydroxyetyl-N-/3-m.etyl-4-/f4-(4-etoxyanilino)fenyl] - <2-metyl-4-{N-hydro-xyetyl-N-[3-(sódium sulf onáto )f enylmetyl] }aminofenyl> /metylén-2,5-dimetyl-2,5-cyklohexa-dién-1-ylidén/] imóniobenzénsulfonátu alebo 3-lN-etyl-N-/3-hydrt}xymetyl-4-/[4-(4-etoxyani-lino)fenyl]-<2-hydroxyaetyl-4-{N-etyl-N-[3-(3Ódíum sulfonáto)fenyl metyl]} aminofenyl]>/metylén-2,5 dihydroxymetyl-2,5-cyklohexadién-1-ylidén/]] imóniobenzénsulfonátu o koncentrá-cii 20 až 100 mg v 100 ml metanolu, potom sa přidá 100 ml roztoku kyseliny chlorovodíkovéjo koncentrácii 2,5 až 8 mól/1 alebo kyseliny chloristej o koncentrácii 0,3 až 1 mól/1 ale-bo kyseliny fosforečnej o koncentrácii 0,8 až 2 mól/1 a nakoniec sa přidá 800 ml roztokuchloridu sodného o koncentrácii 2 až 5 mmól/1, načo sa v druhom stupni k 25 až 300 objemo-vým dielom připraveného reakčného roztoku přidá jeden objemový diel vzorky rozpuštěnéhoproteinu a po 5 minútach reakcie pri izbovej teplote sa zmeria absorbancia pri 560 až620 nm, ktorej hodnota je priamo úměrná koncentrácii meraného proteinu.

Za podmienok podl'a vynálezu možno připravit činidlo k stanoveniu proteinov praktickybez adhezivity farbiva na steny sklenných predmetov, a to jednak v dčsledku.rozpusteniafarbiva v metanole, jednak v ddsledku nahradénia hydrofóbnych alkalických skupin hydrofil-nejšími hydroxyalkylovými skupinami. Příprava činidla k stanoveniu proteinov v biologickýchtekutinách podl’a vynálezu umožňuje stanovenie koncentrácie proteinu nielen v ich zriedenýchroztokoch například v moči, likvore, na ktoré je doteraz obmezené využitie farebnej reakciemedzi farbivom a bielkovinou, ale v závislosti od koncentrácie použitej kyseliny aj v kon-centrovaných roztokoch proteinov, krvnom séru, plazme. Pre stanovenle koncentrácie proteinov 3 232326 v týchto prostrediach je vhodné použit při přípravě činidla roztok koncentrovanejěej mine-rálnej kyseliny, tak ako je uvedené v príkladoch. Přiklad 1 činidlo na stanovenie proteinov sa připraví rozpuštěním 20 mg 3- N-hydroxyetyl-N/3--aetyl-4-/ 4-/4-etoxyanilíno)fenyl - 2-metyl-4- N-hydroxyetyl-K- 3-ísódium sulfonáto)fe- nylmetyl aminofenyl /metylen-2,5-dimetyl-2,5-cyklohexadién-1-ylidén imóniobenzénsulfo-nátu v 100 ml metanolu, načo sa přidá 100 ml kyseliny chlórovodíkovej 6 mól/1 a 800 mlchloridu sodného 2 mmól/1. Přidáním 50 >ul roztoku albuminu hovadzieho séra (5 g/100 ml)v chloride sodnom 1 mmól/1 k 3 ml činidla sa změní hodnota absorbancie po 5 mindtach přiteplote miestnosti o 0,42 (merané při 620 nm). Lineárny rozsah pře stanovenie koncentrá-cie proteinov je za uvedeného usporiadania zabezpečený v rozsahu 0,2 až 6 mg proteinu vovzorke s koeficientom variócie 2,4 % pře n = 10. 1

Príklad2 l Tak ako je uvedené v příklade 1 s tým rozdielom, že k přípravě činidla sa použije 100 mg 3-í[N-etyl-N-/3-metyl-4-/ [4-14-etoxyanilíno)fenyl] - 2-metyl-4-{N-etyl-H~[3-( só- dium sulfonáto)fenylmetyl]}aminofenyl^> /metylén-2,5-dimetyl-2,5-cyklohexadién-1-ylidé'n/Jimó-niobenzénsulfonátu v 100 ml metanolu a přidá sa 100 ml kyseliny chlórovodíkovej 2 mól/1 a800 ml chloridu sodného 5 mmól/1. Prídavkom 30 /ag imunoglobulínu G v 100yul vzorky k 3 mltakto připraveného činidla dochádza k zmene absorbancie pri 18 °C po 5 mindtach o 0,37jednotiek absorbancie (merané pri 595 nm) lineárny rozsah stanovenia koncentrácie je za-bezpečený od 5 až 50/ug imoglobulinu S. Koeficient variócie 3,16 % pre n = 10. Příklad 3

Tak ako v příklade 1 s tým rozdielom, že k príprave činidla sa použije 40 mg 3-fN-e.tyl--N-/3-hydroxyaetyl-4-/ [4-etoxyanilínó).f enyl] - (2-hydroxymetyl-4-{N-etyl-N- Tj-Zsodium sul -fonáto)fenylmetyl]} aminofenyl/J metylén-2,5-dihydroxyaetyl-2,5-cyklohexadién-1-ylidén/imóniobenzénsulfonátu v 100 ml metanolu a 100 ml kyseliny fosforečnej 0,3 mól/1 a 800 mlchloridu sodného 2 mmól/1. Takto připravené činidlo 3 ml reaguje so vzorkou 36 ug albuminuTudského séra v 20 <ul roztokur.chloridu sodného 1 mmól/1 pri teplote miestnosti 23 °C podobu 5 mindt za tvorby farebného komplexu o hodnotě absorbancie 0,193 pri 560 nm. Koefi-cient variácie pre n « 15 je 2,12 %. Příklad 4

Tak ako je uvedené v příklade 3 s tým rozdielom, že sa použije k príprave činidlakyselina fosforečné o koncentrácii 2 mól/1. Takto připravené činidlo (2,5 ml) reaguje s 3 mgferitínu v 100/ul vzorky za vzniku farebného komplexu o hodnotě absorbancie 0,315 pri560 nm. Koeficient variácie pre rt - 10 je 3,85 %. Příklad 5 8 Tak ako je uvedené v příklade 1 s tým rozdielom, že namiesto kyseliny chlórovodíkovej sa použije kyselina chloristá o koncentrácii 0,3 mól/1. Prídavkom 25/ug 1’udskej pankreatickejlalfa amylázy prečistenej do krystalického stavu v 50 /il vzorky sa změní hodnota absorbanciepo 5 minútach a pri teplote miestnosti o 0,262 pri 620 nm. Koeficient variácie 2,35 % preη n 15. Příklad 6

Tak ako je uvedené v příklade 1 s tým rozdielom, že namiesto kyseliny chlorovodíkovejsa použije kyselina chloristá a koncentrácii 1 mól/1. Přidáním 5© /il roztoku albuminu

Claims (1)

1. 232326 4 hovadsieho séra (5 g/100 al) v chloride sodnoa 1 aaól/1 k 3 ml činidle se mění absorbanciapri 620 na o 0,48. Koeficient variácie pre n = 10 Je 3 í. Vynález aá využitie všade, kde je potřebné stanovit rýchlo a presne obsah bielkovln.Zvlášť výhodné je túto metodu využit v klinické;) biochémii pri stanovení bielkovin v bio-logických tekutinách pre diagnostické účely. Dá sa využit i v preayslovej praxi při medzi-operačnej kontrole najma substrótov obsahujúcich vodorozpustné bielkoviny. PREDMET VYNÁLEZU Spflsob stanoveni» koncentrácie bielkovln v biologických materiálech poaocou absorbancievyznačený tým, že v prvom stupni sa připraví roztok 3- jN-etyl-N-/3-aetyl-4-/ [4-(4-etoxyani-llno)fenylj- ^2-metyl-4-{N-etyl-N-[3-(sódium sulfonáto)fenyl metyl]Jaainoetyl/metylén--2,5-diaetyl-2,5 cyklohexadiénvl-ylidén/jimóniobenzénsulfonátu alebo 3-l[N-hydroxyetyl-N-/3--metyl-4-/ [4- (4-etoxyani lino )f enylj - <2-metyl-4- { N-hydroxyetyl-N- [j- (sódium sulf onáto) -fenylaetyljj aminofenyl>/aetylén-2,5-dimetyl-2,5-cyklohexadién-1-ylidén/]] imóniobenzénsulfo-nétu alebo 3-[]jN-etyl-N-/3-hydroxymetyl-4-/£4-etoxyanilino)f enylj -<2-hydroxymetyl-4-^N-etyl--Ν-Γ3-(sódium eulfonáto)fenyl metyl JJ aminofenyl/metylén-2,5 dihydroxymetyl-2,5-cyklo-hexadién-1-ylidén/J imóniobenzénsulfonétu o koncentrácii 20 až 100 mg v 100 ml metanolu, po-tom sa přidá 100 ml roztoku kyseliny chlórovodíkovej o koncentrácii 2,5 až 8 mól/1 alebokyseliny chloristej o koncentrácii 0,3 až 1 mól/1 alebo kyseliny fosforečnej o koncentrácii0,8 až 2 mól/1 a nekoníec sa přidá 800 ml roztoku chloridu sodného o koncentrácii 2 až5 mrnól/1, načo sa v druhou stupni k 25 až 300 objemovým dielom připraveného reakčného roz-tolu přidá jeden objemový dlel vzorky rozpuštěného proteinu a po 5 minútach reakcie priizbovej teplete sa zmesia obsorbancia pri 560 až 620 nm, ktorej hodnota je priamo úměrnékoncentrácii meranéhc proteinu. Severografia, n. p., MOST Cena 2,40 Kčs