CS232326B1 - Spdsob stanovenia koncentrácia bielkovín v biologických materiálech - Google Patents

Spdsob stanovenia koncentrácia bielkovín v biologických materiálech Download PDF

Info

Publication number
CS232326B1
CS232326B1 CS83613A CS61383A CS232326B1 CS 232326 B1 CS232326 B1 CS 232326B1 CS 83613 A CS83613 A CS 83613A CS 61383 A CS61383 A CS 61383A CS 232326 B1 CS232326 B1 CS 232326B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
protein
methyl
phenyl
mol
concentration
Prior art date
Application number
CS83613A
Other languages
English (en)
Slovak (sk)
Other versions
CS61383A1 (en
Inventor
Juraj Zemek
Ludovit Kuniak
Jozef Janis
Original Assignee
Juraj Zemek
Ludovit Kuniak
Jozef Janis
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Juraj Zemek, Ludovit Kuniak, Jozef Janis filed Critical Juraj Zemek
Priority to CS83613A priority Critical patent/CS232326B1/cs
Publication of CS61383A1 publication Critical patent/CS61383A1/cs
Publication of CS232326B1 publication Critical patent/CS232326B1/cs

Links

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Vynález sa týká spOsobu stanovenia koncentrécie bielkovín v biologických materiáloch. PodTa vynálezu sa postupuje tak, že vhodné farbivo s výhodou Coomasie Blue G (C.I. 42655) sa rozpustí v metanole, pridajú sa kyseliny s výhodou kyselina chlórovodíkové, alebo kyselina chloristé, připadne kyselena fosforečné o koncentrácli 0,25 až 0,8 mol/1 a chlorid sodný na potlačenie adhézie na sklenné časti meracej kyvety. Do takto připraveného reakčného roztoku sa přidá roztok obsahujúci bielkovinu, ktoré spčsobuje posun absorpčného pásu a zvýšenie hodnoty absorbancie meraného roztoku. Zvýšenie absorbancie je úměrné koncentrácli prítomnej bielkoviny. Vynález má využitie predovšetkým v klinickej diagnostike pri stanovení bielkovín v rOznych tělových tekutinách, no a6že sa využit lv priemyslovej praxi pri medzioperačnej kontrole přípravy bielkovinových aubstrétov.

Description

232326 2 Přihláška vynálezu aa týká spfisobu stanoveni* koncentrácie bielkovín v biologickýchmateriálech ako v močí, likvore, krvnom sére a ňalšich tekutinách predovšetkýa v pod-nienkach základného a aplikovaného výskumu a v rutinněj analytickéj prevádzke. V doterajšej laboratórnej praxi sa pře stanovenle koncentrácie bielkovín používá kla-sická metoda podlá Lowryho s fenolovým Folinovým činidlom Bowry 0. H., Rosebrough N. J., ř’arrA. L., Randall R. J. i J. Eiol. Chem. 193 (1951) 265 pre vyššie koncentrácie běžná biureto-vá reakcia (Rose 1833) alebo podTa Extona (Reál lexikon der Medizin, Urban and Schwanzenberg,Munchen 1966, s. 206, E 274). V posledněj době sa objavil rad technik založených na tvorběfarebných komplexov medzi farbivom a bielkovinou Bradford Μ. M.: Analyt. Biochem. 72 (1976)248; Sedmak J. J., Grossberg S. E.: Analyt. Biochem. 79 (1977) 544; Spector T.: Analyt.Biochem. §6 (1978) 142.
Tieto metody stí založené na spektrofotometrickon stanovení koncentrácie farebnéhokomplexu farbiva s bielkovinou. Farbivo je v kyslom prostředí v oxidovanom stave, pri vzni-ku komplexu s proteinem sa farbivo redukuje pričom dochádza k posunu absorbančného maximaa k podstatnému nárastu v hodnotě absorbancis. Ako farbivo sa v súčasnosti využívá Coomasiebriliant blue G-250, ¢0 je identické s farbivom Serva Blue G (Color Index fi. 42655) a che-micky je to 3- [[N-etyl-N-/3-metyl-4-/4-(4-etoxyanilino)fenylJ - <2-metyl-4- {N-etyl-N-[3--(sódium sulfonáto)fenyl metyl]} aminofenyl>/metylén-2,5-cyklohexadién-1-ylidén/]] imónio-benzén sulfonát.
Oproti klasickým metodám použitie techniky tvorby farebného komplexu uvedeného farbi-va s bielkovinami má výhodu v rýchlosti převedením analýzy, nevýhoda je však vysoká adhezi-vita farbiva k stenám meracích kyviet. Vysoká citlivost’ metody sa projevuje ako výhodapri stanoveni v moči resp. likvore, kde stačí k analýze aj 10/jl vzorky, znemožňuje všaksúčasne analýzu vzoriek s vysokou koncentráciou proteinov (krvné sérum, plazma).
Uvedené nedostatky rieši spĎeob stanevenia koncentrácie bielkovín v biologických ma-teriálech a to jednak úpravou prostredia analyzovanej tekutiny, jednak modifikáciou štruk-túry farbiva.
Podstata vynálezu spočívá v tom, že v prvom stupni sa připraví roztok 3-[TN-etyl-N--/3-metyl-4-/[4-(4-etoxyanllino)fenyl] -<2-metyl-4-{N-etyl-N-[3-( sódium sulfonáto)f enylmetyl]} aminoetyl]>/metylén-2,5 dimetyl-2,5 cyklohexadién-1-ylidén/]] imóniobenzénsulfo-nátu alebo 3-(£H“hydroxyetyl-N-/3-m.etyl-4-/f4-(4-etoxyanilino)fenyl] - <2-metyl-4-{N-hydro-xyetyl-N-[3-(sódium sulf onáto )f enylmetyl] }aminofenyl> /metylén-2,5-dimetyl-2,5-cyklohexa-dién-1-ylidén/] imóniobenzénsulfonátu alebo 3-lN-etyl-N-/3-hydrt}xymetyl-4-/[4-(4-etoxyani-lino)fenyl]-<2-hydroxyaetyl-4-{N-etyl-N-[3-(3Ódíum sulfonáto)fenyl metyl]} aminofenyl]>/metylén-2,5 dihydroxymetyl-2,5-cyklohexadién-1-ylidén/]] imóniobenzénsulfonátu o koncentrá-cii 20 až 100 mg v 100 ml metanolu, potom sa přidá 100 ml roztoku kyseliny chlorovodíkovéjo koncentrácii 2,5 až 8 mól/1 alebo kyseliny chloristej o koncentrácii 0,3 až 1 mól/1 ale-bo kyseliny fosforečnej o koncentrácii 0,8 až 2 mól/1 a nakoniec sa přidá 800 ml roztokuchloridu sodného o koncentrácii 2 až 5 mmól/1, načo sa v druhom stupni k 25 až 300 objemo-vým dielom připraveného reakčného roztoku přidá jeden objemový diel vzorky rozpuštěnéhoproteinu a po 5 minútach reakcie pri izbovej teplote sa zmeria absorbancia pri 560 až620 nm, ktorej hodnota je priamo úměrná koncentrácii meraného proteinu.
Za podmienok podl'a vynálezu možno připravit činidlo k stanoveniu proteinov praktickybez adhezivity farbiva na steny sklenných predmetov, a to jednak v dčsledku.rozpusteniafarbiva v metanole, jednak v ddsledku nahradénia hydrofóbnych alkalických skupin hydrofil-nejšími hydroxyalkylovými skupinami. Příprava činidla k stanoveniu proteinov v biologickýchtekutinách podl’a vynálezu umožňuje stanovenie koncentrácie proteinu nielen v ich zriedenýchroztokoch například v moči, likvore, na ktoré je doteraz obmezené využitie farebnej reakciemedzi farbivom a bielkovinou, ale v závislosti od koncentrácie použitej kyseliny aj v kon-centrovaných roztokoch proteinov, krvnom séru, plazme. Pre stanovenle koncentrácie proteinov 3 232326 v týchto prostrediach je vhodné použit při přípravě činidla roztok koncentrovanejěej mine-rálnej kyseliny, tak ako je uvedené v príkladoch. Přiklad 1 činidlo na stanovenie proteinov sa připraví rozpuštěním 20 mg 3- N-hydroxyetyl-N/3--aetyl-4-/ 4-/4-etoxyanilíno)fenyl - 2-metyl-4- N-hydroxyetyl-K- 3-ísódium sulfonáto)fe- nylmetyl aminofenyl /metylen-2,5-dimetyl-2,5-cyklohexadién-1-ylidén imóniobenzénsulfo-nátu v 100 ml metanolu, načo sa přidá 100 ml kyseliny chlórovodíkovej 6 mól/1 a 800 mlchloridu sodného 2 mmól/1. Přidáním 50 >ul roztoku albuminu hovadzieho séra (5 g/100 ml)v chloride sodnom 1 mmól/1 k 3 ml činidla sa změní hodnota absorbancie po 5 mindtach přiteplote miestnosti o 0,42 (merané při 620 nm). Lineárny rozsah pře stanovenie koncentrá-cie proteinov je za uvedeného usporiadania zabezpečený v rozsahu 0,2 až 6 mg proteinu vovzorke s koeficientom variócie 2,4 % pře n = 10. 1
Príklad2 l Tak ako je uvedené v příklade 1 s tým rozdielom, že k přípravě činidla sa použije 100 mg 3-í[N-etyl-N-/3-metyl-4-/ [4-14-etoxyanilíno)fenyl] - 2-metyl-4-{N-etyl-H~[3-( só- dium sulfonáto)fenylmetyl]}aminofenyl^> /metylén-2,5-dimetyl-2,5-cyklohexadién-1-ylidé'n/Jimó-niobenzénsulfonátu v 100 ml metanolu a přidá sa 100 ml kyseliny chlórovodíkovej 2 mól/1 a800 ml chloridu sodného 5 mmól/1. Prídavkom 30 /ag imunoglobulínu G v 100yul vzorky k 3 mltakto připraveného činidla dochádza k zmene absorbancie pri 18 °C po 5 mindtach o 0,37jednotiek absorbancie (merané pri 595 nm) lineárny rozsah stanovenia koncentrácie je za-bezpečený od 5 až 50/ug imoglobulinu S. Koeficient variócie 3,16 % pre n = 10. Příklad 3
Tak ako v příklade 1 s tým rozdielom, že k príprave činidla sa použije 40 mg 3-fN-e.tyl--N-/3-hydroxyaetyl-4-/ [4-etoxyanilínó).f enyl] - (2-hydroxymetyl-4-{N-etyl-N- Tj-Zsodium sul -fonáto)fenylmetyl]} aminofenyl/J metylén-2,5-dihydroxyaetyl-2,5-cyklohexadién-1-ylidén/imóniobenzénsulfonátu v 100 ml metanolu a 100 ml kyseliny fosforečnej 0,3 mól/1 a 800 mlchloridu sodného 2 mmól/1. Takto připravené činidlo 3 ml reaguje so vzorkou 36 ug albuminuTudského séra v 20 <ul roztokur.chloridu sodného 1 mmól/1 pri teplote miestnosti 23 °C podobu 5 mindt za tvorby farebného komplexu o hodnotě absorbancie 0,193 pri 560 nm. Koefi-cient variácie pre n « 15 je 2,12 %. Příklad 4
Tak ako je uvedené v příklade 3 s tým rozdielom, že sa použije k príprave činidlakyselina fosforečné o koncentrácii 2 mól/1. Takto připravené činidlo (2,5 ml) reaguje s 3 mgferitínu v 100/ul vzorky za vzniku farebného komplexu o hodnotě absorbancie 0,315 pri560 nm. Koeficient variácie pre rt - 10 je 3,85 %. Příklad 5 8 Tak ako je uvedené v příklade 1 s tým rozdielom, že namiesto kyseliny chlórovodíkovej sa použije kyselina chloristá o koncentrácii 0,3 mól/1. Prídavkom 25/ug 1’udskej pankreatickejlalfa amylázy prečistenej do krystalického stavu v 50 /il vzorky sa změní hodnota absorbanciepo 5 minútach a pri teplote miestnosti o 0,262 pri 620 nm. Koeficient variácie 2,35 % preη n 15. Příklad 6
Tak ako je uvedené v příklade 1 s tým rozdielom, že namiesto kyseliny chlorovodíkovejsa použije kyselina chloristá a koncentrácii 1 mól/1. Přidáním 5© /il roztoku albuminu

Claims (1)

  1. 232326 4 hovadsieho séra (5 g/100 al) v chloride sodnoa 1 aaól/1 k 3 ml činidle se mění absorbanciapri 620 na o 0,48. Koeficient variácie pre n = 10 Je 3 í. Vynález aá využitie všade, kde je potřebné stanovit rýchlo a presne obsah bielkovln.Zvlášť výhodné je túto metodu využit v klinické;) biochémii pri stanovení bielkovin v bio-logických tekutinách pre diagnostické účely. Dá sa využit i v preayslovej praxi při medzi-operačnej kontrole najma substrótov obsahujúcich vodorozpustné bielkoviny. PREDMET VYNÁLEZU Spflsob stanoveni» koncentrácie bielkovln v biologických materiálech poaocou absorbancievyznačený tým, že v prvom stupni sa připraví roztok 3- jN-etyl-N-/3-aetyl-4-/ [4-(4-etoxyani-llno)fenylj- ^2-metyl-4-{N-etyl-N-[3-(sódium sulfonáto)fenyl metyl]Jaainoetyl/metylén--2,5-diaetyl-2,5 cyklohexadiénvl-ylidén/jimóniobenzénsulfonátu alebo 3-l[N-hydroxyetyl-N-/3--metyl-4-/ [4- (4-etoxyani lino )f enylj - <2-metyl-4- { N-hydroxyetyl-N- [j- (sódium sulf onáto) -fenylaetyljj aminofenyl>/aetylén-2,5-dimetyl-2,5-cyklohexadién-1-ylidén/]] imóniobenzénsulfo-nétu alebo 3-[]jN-etyl-N-/3-hydroxymetyl-4-/£4-etoxyanilino)f enylj -<2-hydroxymetyl-4-^N-etyl--Ν-Γ3-(sódium eulfonáto)fenyl metyl JJ aminofenyl/metylén-2,5 dihydroxymetyl-2,5-cyklo-hexadién-1-ylidén/J imóniobenzénsulfonétu o koncentrácii 20 až 100 mg v 100 ml metanolu, po-tom sa přidá 100 ml roztoku kyseliny chlórovodíkovej o koncentrácii 2,5 až 8 mól/1 alebokyseliny chloristej o koncentrácii 0,3 až 1 mól/1 alebo kyseliny fosforečnej o koncentrácii0,8 až 2 mól/1 a nekoníec sa přidá 800 ml roztoku chloridu sodného o koncentrácii 2 až5 mrnól/1, načo sa v druhou stupni k 25 až 300 objemovým dielom připraveného reakčného roz-tolu přidá jeden objemový dlel vzorky rozpuštěného proteinu a po 5 minútach reakcie priizbovej teplete sa zmesia obsorbancia pri 560 až 620 nm, ktorej hodnota je priamo úměrnékoncentrácii meranéhc proteinu. Severografia, n. p., MOST Cena 2,40 Kčs
CS83613A 1983-01-31 1983-01-31 Spdsob stanovenia koncentrácia bielkovín v biologických materiálech CS232326B1 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS83613A CS232326B1 (cs) 1983-01-31 1983-01-31 Spdsob stanovenia koncentrácia bielkovín v biologických materiálech

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS83613A CS232326B1 (cs) 1983-01-31 1983-01-31 Spdsob stanovenia koncentrácia bielkovín v biologických materiálech

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS61383A1 CS61383A1 (en) 1984-02-13
CS232326B1 true CS232326B1 (cs) 1985-01-16

Family

ID=5338544

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS83613A CS232326B1 (cs) 1983-01-31 1983-01-31 Spdsob stanovenia koncentrácia bielkovín v biologických materiálech

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS232326B1 (cs)

Also Published As

Publication number Publication date
CS61383A1 (en) 1984-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
McElderry et al. Six methods for urinary protein compared.
US4492762A (en) Fluorescent polarization immunoassays
US6562581B2 (en) Method for quantitative determination of glycated hemoglobin
EP0514485B1 (en) Glucose measurement control reagent
CA1066176A (en) Protein-assay reagent and method
CS257757B2 (en) Method of reaction determination between antigen and antibody and reaction agent for realization of this process
CN109613280B (zh) 一种血清铁测定试剂盒及其制备方法和应用
Garčic A highly sensitive, simple determination of serum iron using chromazurol B
CH642750A5 (it) Procedimento per la rapida determinazione del ferro nel siero sanguigno e miscela per l&#39;esecuzione del procedimento.
US4143080A (en) Method and reagent for the assay of hydroperoxide
CN116359513B (zh) 一种用于检测尿转铁蛋白的试剂盒
CN113791223B (zh) 一种检测α1-抗胰蛋白酶的免疫比浊试剂盒及其制备方法
US5070198A (en) As-triazine compounds
Connerty et al. Determination of serum calcium by means of sodium alizarinsulfonate
JPH07218511A (ja) 鉄を測定する方法及びその試薬
CS232326B1 (cs) Spdsob stanovenia koncentrácia bielkovín v biologických materiálech
EP0569768A1 (de) Mittel und Verfahren zur Behandlung von Körperflüssigkeiten bei der Bestimmung von Neopterin
Kayamori et al. Enzymatic method for assaying calcium in serum and urine with porcine pancreatic alpha-amylase
Holmes et al. Automation of plasma antithrombin III assays.
Kekki Microdetermination of Amino Nitrogen as Copper Complexes a Modification for Plasma and Urine
EP0287745B1 (en) Method for the determination of albumin in biological fluids
Gustafsson Urinary albumin determination by the immediate bromcresol green method
US3792044A (en) Method for determining glucose with o-toluidine reagent containing an arsenic compound
JPS6125062A (ja) 免疫比濁法によるaso価の測定法
Nolan et al. Continuous-flow enzyme immunoassay for thyroxine in serum.