CS231910B1 - Dvousložkové činidlo pro fotometrické kinetické stanoveni močoviny - Google Patents

Abstract

Dvousložkové činidlo podle vynálezu obsahuje o-ftaldialdehyd a N-/l-naftyl/ethylendiamin, které sestává z vodného roztoku s obsahem o-ftaldialdehydu, kyseliny sírové a neionogenního tensidu a dále z vodného roztoku s obsahem N-/l-naftyl/ethylendiaminu a kyseliny sírové. Dvousložkové činidlo pro fotometrické kinetické stanovení močoviny lze využít v krmivářství, biochemii, v humánní a veterinární diagnostice.

Description

Předmětem vynálezu je dvousložkové činidlo pro fotometrické kinetické stanovení močoviny.

Stanovení močoviny je široce užíváno v krmivářství, biochemii, v humánní a veterinární diagnostice. Pro tyto účely je známa řada metod. Obvyklé je fotometrické stanovení močoviny s některými alfa-diketony a jejich oximy, jako jsou například diacetyl, aoetylbenzoyl, diaoetylmonoxim, dimethylglyoxim a jiné. Močovina s nimi reaguje za zvýšené teploty a v silně kyselém prostředí v přítomnosti některých dalších pomocných látek za vzniku červeně zbarveného pigmentu. Nevýhodou této skupiny látek je, že reakční směs je nutné zahřívat na vysokou teplotu 80 až 100 °C a stanovení lze jen obtížně automatizovat.

Další skupina metod je založena na enzymovém stanovení močoviny enzymem ureázou, která katalyzuje její rozklad na amoniak a kysličník uhličitý. Určuje se obvykle amoniak některou z reakcí stanovení amoniaku, například po jeho převedení na barevný indofenol postupem podle Berthelota. I když je enzymové stanovení specifické, je poměrně pracné. Společnou nevýhodou všech uvedených postupů je obtížnost jejich automatizace, měření nelze provádět kineticky.

V tomto ohledu je výhodnější stanovení močoviny o-ftaldialdehydem a N-/l-naftyl/ethylendiaminem, například v prostředí kyseliny sírové, kdy vzniká červeně zbarvený reakční produkt již při pokojové nebo jen mírně zvýšené teplotě 37 °C. Fotometrické stanovení lze provádět kineticky sledováním změny absorbance inkubační směsi v intervalu jedné až pěti minut po smíchání všech reagujících složek.

Postup stanovení byl například popsán D. Jungem a spol. v Clin. Chemistry 21, 1 136 až 1 140 /1975/. Při aplikaci této metody pro stanovení močoviny ve vzorcích obsahujících bílkoviny, například v živočišných nebo lidských sérech, bylo zjištěno, že v inkubační směsi se vzorkem vzniká často zákal, který stanovení ruší. Vznik a intenzita zákalu závisejí na typu vzorku. V těchto případech nelze stanovení provést. Tímto postupem tedy nelze spolehlivě analyzovat zejména bílkovinné vzorky močoviny, a je proto žádoucí připravit činidlo, které by umožňovalo fotometrické kinetické stanovení i v těchto případech.

K odstranění těchto nedostatků směřuje dvousložkové činidlo pro kinetické fotometrické stanovení močoviny na bázi o-ftaldialdehydu a N-/l-naftyl/ethylendiaminu /podle vynálezu/, jehož podstata spočívá v tom, že prvá složka je tvořena vodným roztokem obsahujícím na 1 hmotnostní díl o-ftaldialdehydu 1 až 580 hmotnostních dílů kyseliny sírové a 5 až 40 hmotnostních dílů neionogenního tenzidů, s výhodou ethoxylovaného oleylalkoholu, laurylalkoholu nebo myristylalkoholu a druhá složka je tvořena vodným roztokem, obsahujícím na 1 hmotnostní díl N-/l-naftyl/-ethylendiaminu ve formě báze nebo soli, například ve formě diohloridu nebo sulfátu, 0,5 až 4 hmotnostní díly kyseliny sírové.

Dvousložkové činidlo podle vynálezu umožňuje rychlé a spolehlivé stanovení močoviny fotometrickou kinetickou metodou i ve vzorcích obsahujících bílkoviny, například v živočišných sérech, aniž by v inkubační směsi vznikal nežádoucí zákal. Přítomnost neionogénního tenzidů na bázi ethoxylovaných vyšších alkoholů má specifický vliv na potlačení zákalu působeného bílkovinami a současně solubilizuje a stabilizuje o-ftaldialdehyd. Při stanovení močoviny ve vzorcích obsahujících až 10 hmotnových procent bílkovin je tvorba zákalu zcela potlačena a kalibrační funkce dA = f/c/, kde c je koncentrace močoviny ve vzorku v mmol/1, má lineární průběh až do obsahu močoviny 50 mmol/1.

činidlo podle vynálezu je vhodné připravovat ve formě dvou roztoků jednak s ohledem na jeho vyšší stabilitu, jednak proto, že s ním lze provádět fotometrické kinetické stanovení močoviny různými postupy a s využitím různých typů automatických kinetických analyzátorů, nebo i manuálně pomocí jednoduchého digitálního fotometru.

Jak bylo nalezeno, s činidlem podle vynálezu jsou i při analýze krevních sér získány přesné a správné hodnoty močoviny, korelující se stanovením močoviny diacetylmonoximem nebo se stanovením enzymovým. Činidlo podle vynálezu lze vyrábět ve stabilní formě z dostupných surovin.

Příklad 1

Připraví se 2 200 ml vodného roztoku obsahujícího 1,3 g o-ftaldialdehydu, 20 g ethoxylovaného oleylalkoholu a 0,7 ml koncentrované kyseliny sírové.

Připraví se 800 ml vodného roztoku obsahujícího 1,3 g N-/l-naftyl/ethylendiamin dihydrochloridu a 180 ml koncentrované kyseliny sírové.

I

Příklad 2

Připraví se 250 ml vodného roztoku obsahujícího 0,1 g o-ftaldialdehydu, 36 g koncentrované kyseliny sírové a 0,5 g ethoxylovaného myristylalkoholu.

Připraví se 80 ml vodného roztoku obsahujícího 0,1 g N-/l-naftyl/ethylendiamin«sulfátu a 10 g koncentrované kyseliny sírové.

Příklad 3

Připraví se 250 ml vodného roztoku obsahujícího 0,1 g o-ftaldialdehydu, 58 g koncentrované kyseliny sírové a 4 g etljoxylovaného laurylalkoholu.

Připraví se 50 ml vodného roztoku obsahujícího 0,1 g N/l-naftyl/ethylendiaminu a 0,05 g koncentrované kyseliny sírové.

Příklad4

Oba roztoky činidel podle vynálezu z příkladů 1 až 3 se před analýzou vytemperují na 37 °C. Do temperované kyvety fotometru se odměří 2,5 ml roztoku o-ftaldialdehydu podle příkladů 1 až 3, přidá se 0,05 ml vzorku a reakce se nastartuje 0,5 ml roztoku N-/l-naftyl/ethylendiaminu podle příkladů 1 až 3. Sleduje se změna absorbance mezi 30 až 90 s pó startu. Ze změny absorbance vzorku /dA^y, standardu močoviny /dA₂/ a blenku obsahujícího místo vzorku vodu /dAg/ se vypočte obsah močoviny ve vzorku.

Je možné postupovat i tak, že se bezprostředně před analýzou smíchají oba roztoky podlevynálezu podle příkladů 1 až 3 v poměru 5 : 1, ke 3 ml směsi se přidá 0,05 ml vzorku a sleduje se změna absorbance podobně jako v předešlém případě.

Claims (1)

1. Dvousložkové činidlo pro fotometrioké kinetické stanovení močoviny na bázi o-ftaldialdehydu a N-/l-naftyl/ethylendiaminu, vyznačené tím, že prvá složka je tvořena vodným roztokem obsahujícím na 1 hmotnostní díl o-ftaldialdehydu 1 až 580 hmotnostních dílů kyseliny sírové a 5 až 40 hmotnostních dílů neionogenního tenzidu, s výhodou ethoxylovaného oleylalkoholu, laurylalkoholu nebo myristylalkoholu a druhá složka vodním roztokem obsahujícím na 1 hmotnostní díl N-/l-naftyl/ethylendiaminu ve formě báze nebo soli, například dihydrochloridu nebo • sulfátu 0,5 až 4 hmotnostních dílů kyseliny sírové.