CS231910B1

CS231910B1 - Two component agent for photometric kinetic urea determination

Info

Publication number: CS231910B1
Application number: CS827496A
Authority: CS
Inventors: Vratislav Chromy; Hana Konecna
Original assignee: Vratislav Chromy; Hana Konecna
Priority date: 1982-10-22
Filing date: 1982-10-22
Publication date: 1984-12-14
Also published as: CS749682A1

Abstract

Dvousložkové činidlo podle vynálezu obsahuje o-ftaldialdehyd a N-/l-naftyl/ethylendiamin, které sestává z vodného roztoku s obsahem o-ftaldialdehydu, kyseliny sírové a neionogenního tensidu a dále z vodného roztoku s obsahem N-/l-naftyl/ethylendiaminu a kyseliny sírové. Dvousložkové činidlo pro fotometrické kinetické stanovení močoviny lze využít v krmivářství, biochemii, v humánní a veterinární diagnostice.The two-component agent of the invention comprises o-phthalialdehyde and N- (1-naphthyl) ethylenediamine, which consists of an aqueous solution containing o-phthalialdehyde, sulfuric acid and nonionic surfactant and further from aqueous of a solution containing N- (1-naphthyl) ethylenediamine and sulfuric acid. Two component reagent for photometric urea kinetic determination can be used feed, biochemistry, human and veterinary diagnostics.

Description

Předmětem vynálezu je dvousložkové činidlo pro fotometrické kinetické stanovení močoviny.The present invention provides a two-component reagent for photometric kinetic determination of urea.

Stanovení močoviny je široce užíváno v krmivářství, biochemii, v humánní a veterinární diagnostice. Pro tyto účely je známa řada metod. Obvyklé je fotometrické stanovení močoviny s některými alfa-diketony a jejich oximy, jako jsou například diacetyl, aoetylbenzoyl, diaoetylmonoxim, dimethylglyoxim a jiné. Močovina s nimi reaguje za zvýšené teploty a v silně kyselém prostředí v přítomnosti některých dalších pomocných látek za vzniku červeně zbarveného pigmentu. Nevýhodou této skupiny látek je, že reakční směs je nutné zahřívat na vysokou teplotu 80 až 100 °C a stanovení lze jen obtížně automatizovat.Determination of urea is widely used in animal feed, biochemistry, human and veterinary diagnostics. A number of methods are known for this purpose. Usually, photometric determination of urea with some alpha-diketones and their oximes, such as diacetyl, aoethylbenzoyl, diaoethylmonoxime, dimethylglyoxime and others, is common. The urea reacts with them at elevated temperature and in a strongly acidic environment in the presence of some other excipients to form a red pigment. A disadvantage of this group of substances is that the reaction mixture must be heated to a high temperature of 80-100 ° C and the assay can be difficult to automate.

Další skupina metod je založena na enzymovém stanovení močoviny enzymem ureázou, která katalyzuje její rozklad na amoniak a kysličník uhličitý. Určuje se obvykle amoniak některou z reakcí stanovení amoniaku, například po jeho převedení na barevný indofenol postupem podle Berthelota. I když je enzymové stanovení specifické, je poměrně pracné. Společnou nevýhodou všech uvedených postupů je obtížnost jejich automatizace, měření nelze provádět kineticky.Another group of methods is based on the enzymatic determination of urea by the enzyme urease, which catalyses its decomposition into ammonia and carbon dioxide. Usually the ammonia is determined by one of the reactions of the determination of ammonia, for example after its conversion to the colored indophenol by the Berthelot method. Although the enzyme assay is specific, it is relatively laborious. The common disadvantage of all these procedures is the difficulty of their automation;

V tomto ohledu je výhodnější stanovení močoviny o-ftaldialdehydem a N-/l-naftyl/ethylendiaminem, například v prostředí kyseliny sírové, kdy vzniká červeně zbarvený reakční produkt již při pokojové nebo jen mírně zvýšené teplotě 37 °C. Fotometrické stanovení lze provádět kineticky sledováním změny absorbance inkubační směsi v intervalu jedné až pěti minut po smíchání všech reagujících složek.In this regard, the determination of urea with o-phthalialdehyde and N- (1-naphthyl) ethylenediamine is preferred, for example in a sulfuric acid environment where a red-colored reaction product is formed at room temperature or only slightly elevated temperature of 37 ° C. The photometric assay can be performed kinetic by monitoring the change in absorbance of the incubation mixture at one to five minutes after mixing of all reactants.

Postup stanovení byl například popsán D. Jungem a spol. v Clin. Chemistry 21, 1 136 až 1 140 /1975/. Při aplikaci této metody pro stanovení močoviny ve vzorcích obsahujících bílkoviny, například v živočišných nebo lidských sérech, bylo zjištěno, že v inkubační směsi se vzorkem vzniká často zákal, který stanovení ruší. Vznik a intenzita zákalu závisejí na typu vzorku. V těchto případech nelze stanovení provést. Tímto postupem tedy nelze spolehlivě analyzovat zejména bílkovinné vzorky močoviny, a je proto žádoucí připravit činidlo, které by umožňovalo fotometrické kinetické stanovení i v těchto případech.The assay procedure has been described, for example, by D. Jung et al. in Clin. Chemistry 21, 1136-11140 (1975). When applying this method for the determination of urea in samples containing proteins, such as animal or human sera, it has been found that turbidity often occurs in the incubation mixture with the sample, which interferes with the assay. Formation and intensity of haze depend on sample type. In these cases, the assay cannot be performed. Thus, in particular, urea protein samples cannot be reliably analyzed by this procedure, and it is therefore desirable to provide an agent that would permit photometric kinetic determination even in these cases.

K odstranění těchto nedostatků směřuje dvousložkové činidlo pro kinetické fotometrické stanovení močoviny na bázi o-ftaldialdehydu a N-/l-naftyl/ethylendiaminu /podle vynálezu/, jehož podstata spočívá v tom, že prvá složka je tvořena vodným roztokem obsahujícím na 1 hmotnostní díl o-ftaldialdehydu 1 až 580 hmotnostních dílů kyseliny sírové a 5 až 40 hmotnostních dílů neionogenního tenzidů, s výhodou ethoxylovaného oleylalkoholu, laurylalkoholu nebo myristylalkoholu a druhá složka je tvořena vodným roztokem, obsahujícím na 1 hmotnostní díl N-/l-naftyl/-ethylendiaminu ve formě báze nebo soli, například ve formě diohloridu nebo sulfátu, 0,5 až 4 hmotnostní díly kyseliny sírové.The two-component kinetic photometric determination of urea based on o-phthalialdehyde and N- (1-naphthyl) ethylenediamine (according to the invention) is based on the fact that the first component consists of an aqueous solution containing per part by weight of o -phthalialdehyde 1 to 580 parts by weight of sulfuric acid and 5 to 40 parts by weight of nonionic surfactants, preferably ethoxylated oleyl alcohol, lauryl alcohol or myristyl alcohol, and the second component consists of an aqueous solution containing, for 1 part by weight, N- (1-naphthyl) ethylenediamine base or salt, for example in the form of di-chloride or sulfate, 0.5 to 4 parts by weight of sulfuric acid.

Dvousložkové činidlo podle vynálezu umožňuje rychlé a spolehlivé stanovení močoviny fotometrickou kinetickou metodou i ve vzorcích obsahujících bílkoviny, například v živočišných sérech, aniž by v inkubační směsi vznikal nežádoucí zákal. Přítomnost neionogénního tenzidů na bázi ethoxylovaných vyšších alkoholů má specifický vliv na potlačení zákalu působeného bílkovinami a současně solubilizuje a stabilizuje o-ftaldialdehyd. Při stanovení močoviny ve vzorcích obsahujících až 10 hmotnových procent bílkovin je tvorba zákalu zcela potlačena a kalibrační funkce dA = f/c/, kde c je koncentrace močoviny ve vzorku v mmol/1, má lineární průběh až do obsahu močoviny 50 mmol/1.The two-component reagent of the invention allows rapid and reliable determination of urea by the photometric kinetic method even in protein-containing samples, for example in animal sera, without causing undesirable turbidity in the incubation mixture. The presence of nonionic surfactants based on ethoxylated higher alcohols has a specific effect on the suppression of turbidity caused by proteins, while at the same time solubilizing and stabilizing o-phthaldialdehyde. In the determination of urea in samples containing up to 10 weight percent protein, turbidity is completely suppressed and the calibration function dA = f / c /, where c is the urea concentration in the sample in mmol / l, has a linear course up to a urea content of 50 mmol / l.

činidlo podle vynálezu je vhodné připravovat ve formě dvou roztoků jednak s ohledem na jeho vyšší stabilitu, jednak proto, že s ním lze provádět fotometrické kinetické stanovení močoviny různými postupy a s využitím různých typů automatických kinetických analyzátorů, nebo i manuálně pomocí jednoduchého digitálního fotometru.The reagent according to the invention is suitable to be prepared in the form of two solutions both because of its higher stability and because it can be used for photometric kinetic determination of urea by various methods and using different types of automatic kinetic analyzers, or even manually using a simple digital photometer.

Jak bylo nalezeno, s činidlem podle vynálezu jsou i při analýze krevních sér získány přesné a správné hodnoty močoviny, korelující se stanovením močoviny diacetylmonoximem nebo se stanovením enzymovým. Činidlo podle vynálezu lze vyrábět ve stabilní formě z dostupných surovin.As has been found, accurate and correct urea values, correlated with the urea diacetylmonoxime assay or the enzyme assay, are obtained with the reagent of the invention even in blood serum analysis. The agent of the invention can be produced in stable form from available raw materials.

Příklad 1Example 1

Připraví se 2 200 ml vodného roztoku obsahujícího 1,3 g o-ftaldialdehydu, 20 g ethoxylovaného oleylalkoholu a 0,7 ml koncentrované kyseliny sírové.2200 ml of an aqueous solution containing 1.3 g of o-phthalialdehyde, 20 g of ethoxylated oleyl alcohol and 0.7 ml of concentrated sulfuric acid are prepared.

Připraví se 800 ml vodného roztoku obsahujícího 1,3 g N-/l-naftyl/ethylendiamin dihydrochloridu a 180 ml koncentrované kyseliny sírové.800 ml of an aqueous solution containing 1.3 g of N- (1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride and 180 ml of concentrated sulfuric acid are prepared.

IAND

Příklad 2Example 2

Připraví se 250 ml vodného roztoku obsahujícího 0,1 g o-ftaldialdehydu, 36 g koncentrované kyseliny sírové a 0,5 g ethoxylovaného myristylalkoholu.250 ml of an aqueous solution containing 0.1 g of o-phthalialdehyde, 36 g of concentrated sulfuric acid and 0.5 g of ethoxylated myristyl alcohol are prepared.

Připraví se 80 ml vodného roztoku obsahujícího 0,1 g N-/l-naftyl/ethylendiamin«sulfátu a 10 g koncentrované kyseliny sírové.80 ml of an aqueous solution containing 0.1 g of N- (1-naphthyl) ethylenediamine sulphate and 10 g of concentrated sulfuric acid are prepared.

Příklad 3Example 3

Připraví se 250 ml vodného roztoku obsahujícího 0,1 g o-ftaldialdehydu, 58 g koncentrované kyseliny sírové a 4 g etljoxylovaného laurylalkoholu.250 ml of an aqueous solution containing 0.1 g of o-phthalialdehyde, 58 g of concentrated sulfuric acid and 4 g of ethoxylated lauryl alcohol are prepared.

Připraví se 50 ml vodného roztoku obsahujícího 0,1 g N/l-naftyl/ethylendiaminu a 0,05 g koncentrované kyseliny sírové.50 ml of an aqueous solution containing 0.1 g of N / 1-naphthyl / ethylenediamine and 0.05 g of concentrated sulfuric acid are prepared.

Příklad4Example4

Oba roztoky činidel podle vynálezu z příkladů 1 až 3 se před analýzou vytemperují na 37 °C. Do temperované kyvety fotometru se odměří 2,5 ml roztoku o-ftaldialdehydu podle příkladů 1 až 3, přidá se 0,05 ml vzorku a reakce se nastartuje 0,5 ml roztoku N-/l-naftyl/ethylendiaminu podle příkladů 1 až 3. Sleduje se změna absorbance mezi 30 až 90 s pó startu. Ze změny absorbance vzorku /dA^y, standardu močoviny /dA₂/ a blenku obsahujícího místo vzorku vodu /dAg/ se vypočte obsah močoviny ve vzorku.Both reagent solutions of Examples 1 to 3 were allowed to warm to 37 ° C prior to analysis. 2.5 ml of the o-phthalialdehyde solution according to Examples 1 to 3 are metered into a tempered cuvette of the photometer, 0.05 ml of the sample is added and the reaction is started with 0.5 ml of the N- (1-naphthyl) ethylenediamine solution according to Examples 1 to 3. The change in absorbance between 30 and 90 sec. The urea content of the sample is calculated from the change in absorbance of the sample (dA 2), the urea standard (dA ₂ ) and the blank containing water (dAg) instead of the sample.

Je možné postupovat i tak, že se bezprostředně před analýzou smíchají oba roztoky podlevynálezu podle příkladů 1 až 3 v poměru 5 : 1, ke 3 ml směsi se přidá 0,05 ml vzorku a sleduje se změna absorbance podobně jako v předešlém případě.Alternatively, both solutions of Examples 1 to 3 are mixed in a 5: 1 ratio immediately prior to analysis, 0.05 ml of the sample is added to 3 ml of the mixture and the change in absorbance is monitored similarly to the previous case.

Claims

A two-component reagent for photometriocinetic determination of urea based on o-phthalialdehyde and N- (1-naphthyl) ethylenediamine, characterized in that the first component consists of an aqueous solution containing 1 to 580 parts by weight of sulfuric acid and 1 to 580 parts by weight of o-phthalialdehyde 40 parts by weight of a nonionic surfactant, preferably ethoxylated oleyl alcohol, lauryl alcohol or myristyl alcohol, and the second component with an aqueous solution containing, per 1 part by weight of N- (1-naphthyl) ethylenediamine in base or salt form, e.g. dihydrochloride or sulfate 0.5 to 4 parts by weight sulfuric acid.