CS231796B1 - Sposob zmrazovania kancej spermy - Google Patents

Description

Vynález rieši sposob konzervácie a uskladnenia kančej spermy pre neobmedzené časové a priestorové použitie.

Doterajšie spracovanie a konzervácia kančej spermy sa uskutočňuje pri běžných fyziologických teplotách, čo neumožňuje jeho konzerváciu a uskladnenie pre neobmedzené časové použitie. Tieto metody v podstatě predstavujú len riedenie čerstvej kančej spermy s možnostou použitia do 5 dní po jeho odobratí od plemenníkov. Sú známe pokusy zmrazovania kančieho spermatu prispósobením metody zmrazovania býčieho spermatu. Pri tomto sposobe sa dosiahli dost dobré výsledky v motilite 25 až 30 %, avšak zabrezávanie bolo velmi nízké 20 až 25 %. Je známa i metoda zmrazovania kančieho spermatu v polyamidových trubičkách. Pri tejto metóde sa získalo zabrezávanie 38 %, motilita 30 až 35 %, a 55 až 60 percent normálnych akrozomov. Uvedené metódy konzervácie kančej spermy majú nevýhody v nízkej prašnosti a plodnosti prasnic, čoho dósledkom je nízká efektivnost pri zabezpečovaní reprodukcie v chove ošípaných, čo bráni využívaniu v širokej plemenárskej praxi.

Uvedené nedostatky odstraňuje sposob zmrazovania kančej spermy podlá vynálezu, ktorého podstatou je, že přefiltrovaný a odštáty ejakulát sa odstředí pri otáčkách 2800 až 3000 min.^-1 po dobu 5 min., po ktorých sa oddělí semenná plazma a čistá koncentrovaná sperma sa predriedi riedidlom, připraveným homogenizáciou vaječného žítka, TES — N — TRIS pozostávajúceho z hydroxymetylu, metyl-2-aminoetanu, kyseliny sírovej, THIS pozostávajúceho z aminoetanu a hydroxymetylu, glukózy, glycerínu a natriumlaurylsulfátu s redestilovanou vodou, riedidlo sa odstředí pri otáčkách 10 000 min.^-1 a přidává sa v množstve 5 ml na 1 inseminačnú dávku, ochladí sa na 5 °C, pričom sa do riedidla přidá glycerín s podieloim 2 % hm. a týmto sa dorieďuje po kvapkách v množstve 5 ml na 1 inseminačnú dávku za stálého miešania, po ktorom sa zmrazuje v suchom lade a tekutom dusíku.

Množstvo riedidla na predriedenie koncentrovanej spermy sa vypočítá podlá vztahu _π (O X A X K) — P

R - g pričom

R — počet dávok

O — objem čerstvého ejakulátu použitého na odstredenie

Á — aktivita v % čerstvého ejakulátu K — koncentrácia v tis. spermií čerstvého ejakulátu

P — percento pathologických spermií

Zmrazovanie sa vykonává na suchom lade, v ktorom sa predtým vyhlbili jamky na pilulky, pričom nakvapkávanie sa vykonává na velkost 0,2 ml. Po zmrazení sa pilulky presypú do tekutého dusíka, kde móžu byť skladované neobmedzene dlhú dobu.

Před použitím sa pilulky rozmrazia v rozmrazovacej tekutině, ktorá sa připraví rozpuštěním chelatonu IV, glukózy, hydrouhličitanu sodného a citrátu sodného v redestilovanej vodě pri 38 °C. Na rozmrazenie jednej inseminačnej dávky, t. j. 50 piluliek sa použije 70 ml rozmrazovacej tekutiny 50 °C teplej.

Výhodou navrhovaného spósobu podlá vynálezu je, že umožňuje spracovanie, konzerváciu a uskladnenie kančej spermy s možnostou rozmrazovania pri výkone inseminácie prasnic, čo umožňuje využívat insemináciu ošípaných bez časového a priestorového obmedzenia tak, ako je to u hovadzieho dobytka. Přitom dosiahnuté výsledky plodnosti zmrazenou spermou predstihujú výsledky plodnosti dosiahnuté čerstvou spermou. Zmrazovanie spermy umožňuje podstatné zdokonalenie reallzácle priparovania a tým i uplatnenie dosial' nemožných metod plemenltby a šlachtenia ošípaných.

V nasledujúcej časti je vynález objasněný príkladom přípravy ejakulátu před zmrazovaním a insemináciou, ktorým sa samozřejmé jeho rozsah nevyčerpáva, ani inak neobmedzuje.

Příklad prevedenia

Ejakulát odobratý ručnou metodou do 500 ml skleněného odběrného valca umiestneného v umelej vagíně vytemperovanej teplou vodou v plášti vagíny na 37 °C sa preleje cez dvojitý filter sterilnej gázy do odmerného valca o obsahu 500 ml.

Z množstva získaného ejakulátu sa odoberie 10 ml pre účely laboratórneho vyšetrenia. Sperma v odmernom válci sa ponechá odstát 30 až 60 min., čo je ekvilibračná doba, pri laboratórnej teplote. Počas tejto doby sa prevedie laboratorně vyšetřeme ejakulátu. Zistí sa pH acidimetrom, pričom hodnoty majú byť v rozmedzí 6,8 až 7,2. Aktivita sa zistí mikroskopicky, najnižšia hodnota 70 %. Koncentrácia sa zistí fotokolorimetricky, alebo na Burgerovej komórke; najnižšia hodnota 250 tis. na ml. Morfologické změny sa zistia metodou podlá Farellyho, přípustné morfologické změny sú do 20 %, z toho nezrelých spermií s protoplazmatickou kvapkou do 10 °/o.

Ďalej sa připraví riedidlo, ktoré pozostáva z

TES—N—TRIS (hydroxymetyl, metyl-2-aminoetan, kyselina sírová) v množstve 1,1 g

TRIS (hydroxymetyl, aminoetan) v množstve 2,2 g glukózy 3,2 g glycerolu 3 °/o, t. j. 3,3 g vaječného žítku 22 ml natrium-lauril-sulfátu 0,5 ml natriumlaurylsulfátu 0,5 ml

Riedidlo sa připraví tak, že vaječný žítok po přidaní 10 ml redestilovanej vody sa liomogenizuje mixerom po dobu 5 min. Medzi tým sa ďalšie komponenty: TES—N—TRIS, TRIS a glukóza rozpustia v 50 ml redestilovanej vody 40 °C teplej. Po rozpuštění komponentov a dokladnej homogenizácii sa žítok vleje do rozpuštěných častí riedidla. Po premiešaní sa obsah doplní redestilovanou vodou 35 °C teplou na 100 ml. V dalšom sa přidá 0,5 ml natriumlaurylsulfátu a 3,3 ml glycerínu. Takto připravené riedidlo sa odstreďuje v skúmavkách s obsahom 8 mililitrov na odstredivke po dobu 8 min. pri otáčkách 10 000 min.^-1. Po odstředění sa tekutý obsah riedidla preleje do odmerné< ho valca s obsahom 150 ml, sediment sa zo skúmaviek odstráni a v ďalšom sa nepoužívá.

“ Po uplynutí ekvilibračnej doby sa ejakulát v odmernom válci premieša a rozdělí sa do skúmaviek s obsahom 12 ml a odstreďuje sa na odstredivke bežne používanej pri zisťovaní tukovosti mlieka pri otáčkách 1375 min.^-1 po dobu 20 min. Můžu sa použit i otáčky 2800 až 3000 min.¹ po dobu 5 min. Po odstředění sa semenná plazma zo skúmaviek odsaje a v skúmavke ostane čistá koncentrovaná sperma. Teplote spermy sa prisposobí i teplota riedidla, ktoré sa do jednotlivých skúmaviek přidá po kvapkách za stálého miešania v množstve vypočítanom podlá vzorca (O X A X Kj — P ^R ~ 5

Na jednu inseminačnú dávku sa použije 5 ml riedidla.

Po ukončení predriedenia sa predriedená sperma vleje do flakonu určeného pre insemináciu ošípaných a takto připravená sa vloží do vodného kúpela tak, aby teplota kúpela a predriedenej spermy bola rovnaká. Schladzovanie prebieha postupné v chladničke, ktorá je nastavená na teplotu +5 °C. Schladzovanie na uvedenú teplotu trvá 90 až 120 min. Zároveň sa připraví z ostávajúcej časti riedidla množstvo na doriedenie po schladení. Použijú sa tie množstvá riedidla, ktoré boli použité na predriedenie. Do připraveného množstva riedidla sa přidá glycerín podielom 2 % hm, t. j. 3,3 ml a dobré premiešané sa vloží do chladničky k schladeniu na +5 °C.

Po schladení predriedenej spermy a riedidla sa pristúpi k doriedovaniu, ktoré sa robí postupné po dvoch až troch kvapkách pomocou pipety za stálého miešania. Na jednu inseminačnú dobu sa použije 5 ml riedidla na doriedenie. Po doriedení sa ihneď zmrazuje.

Zmrazovanie prebieha v suchom lade, v ktorom sa vyhíbili jamky na pilulky. Nakvapkávanie sa vykonává pipetou na velkost 0,2 ml. Zmrazovanie na suchom lade trvá 7 min. Po zmrazení sa pilulky presypú cez lievik do masťoviek, v ktorých je tekutý dusík. Takto zmrazená sperma sa uskladňuje v kontajneroch, kde může byť skladovaná v tekutom dusíku neobmedzenú dobu.

K rozmrazovaniu piluliek před insemináciou sa použije rozmrazovacia tekutina, ktorá sa připraví rozpuštěním chelatonu IV v množstve 1,2 g, glukózy v množstve 60 g, hydrouhličitanu sodného v množstve 0,40 g a citrátu sodného v množstve 1,5 g v 1000 mililitrov redestilovanej vody pri teplote 38 °C.

Jedna inseminačná dávka představuje 50 piluliek, ktoré sa vyberú z kontajnera a nechajú sa odpařit po dobu 60 až 90 sek. Po odpaření sa pilulky postupné vysypú do rozmrazovacej tekutiny ohriatej na 50 °C a obsahu 70 ml. Rozmrazovacia tekutina je ohrievaná priamo vo flakone vo vodnej kúpeli. Takto připravená inseminačná dávka sa ihned' použije k inseminácii.

Claims (1)

1. PREDMET

   Sposob zmrazovania kančej spermy v tekutom dusíku vyznačujúci sa tým, že sa odobratý ejakulát pri teplote 37 °C přefiltruje, nechá sa odstát na dobu 30 až 60 min, po ktorej sa rozdělí do skúmaviek a odstreduje sa pri otáčkách 2800 až 3000 min¹ po dobu 5 min, po ktorých sa semenná plazma oddělí a čistá koncentrovaná sperma sa predriedi riedidlom, připraveným homogenizáciou vaječného žítka, TES—N—TRIS pozostávajúceho z hydroxymetylu, metyl-2-aminoetanu, kyseliny sírovej, TRIS pozoVYNALEZU stávajúceho z aminoetanu a hydroxymetylu, glukózy, glycerínu a natriumlaurylsulfátu s redestilovanou vodou, riedidlo sa odstředí pri otáčkách 10 000 min¹ a přidává sa v množstve 5 ml na jednu inseminačnú dávku, ochladí sa na 5 °C, pričom sa do riedidla přidá glycerín s podielom 2 % hm. a týmto sa dorieduje po kvapkách v množstve 5 ml na jednu inseminačnú dávku za stálého miešania, po ktorom sa zmrazuje v suchom 1'ade a tekutom dusíku.