CS231796B1 - Sposob zmrazovania kancej spermy - Google Patents

Abstract

Podstatou spcisobu zmrazovania podta vynálezu je, že odobratý ejakulát sa po ekvilibračnej době odstraňuje pri otáčkách 2800 až 3000 min.-1 po dobu 5 min., po kterých sa semenná plazma oddělí, predriedi riedidlom a ochladí sa na 5 °C. Do riedidla sa pridajú 2 °/o glycerínu a týmto sa po vychladení predriedenej spermy doriedi. Po doriedení sa zmrazuje v' suchom 1'ade a v tekutom dusíku, pričom před insemináciou sa rozpustí v rozmrazovacej tekutině. Vynález je možné využit na pehovanie kančej spermy pre insemináciu ošípaných bez časového a priestorového obmedzenia tak, ako je to u hovadzieho dobytka.

Description

231796

Vynález rieši sposob konzervácie a u-skladnenia kančej spermy pre neobmedzenéčasové a priestorové použitie.

Doterajšie spracovanie a konzervácia kan-čej spermy sa uskutočňuje pri běžných fy-ziologických teplotách, čo neumožňuje je-ho konzervárnu a uskladnenie pre neobme-dzené časové použitie. Tieto metody v pod-statě predstavujú len riedenie čerstvej kan-čej spermy s možnosťou použitia do 5 dnípo jeho odobratí od plemenníkov. Sú známepokusy zmrazovania kančieho spermatu pri-spósobením metody zmrazovania býčiehospermatu. Pri tomto sposobe sa dosiahlidosť dobré výsledky v motilite 25 až 30 °/o,avšak zabrezávanie bolo velmi nízké 20 až25 %. Je známa i metoda zmrazovania kan-čieho spermatu v polyamidových trubič-kách. Pri tejto metóde sa získalo zabrezá-vanie 38 %, motilita 30 až 35 %, a 55 až 60percent normálnych akrozomov. Uvedenémetódy konzervácie kančej spermy majúnevýhody v nízkej prašnosti a plodnostiprasnic, čoho dósledkom je nízká efektiv-nost pri zabezpečovaní reprodukcie v cho-ve ošípaných, čo bráni využívaniu v širokejplemenárskej praxi.

Uvedené nedostatky odstraňuje sposobzmrazovania kančej spermy podlá vynálezu,ktorého podstatou je, že přefiltrovaný a od-štáty ejakulát sa odstředí pri otáčkách 2800až 3000 min.-1 po dobu 5 min., po ktorýchsa oddělí semenná plazma a čistá koncen-trovaná sperma sa predriedi riedidlom, při-praveným homogenizáciou vaječného žítka,TES — N — TRIS pozostávajúceho z hydro-xymetylu, metyl-2-aminoetanu, kyseliny sí-rovej, THIS pozostávajúceho z aminoetanua hydroxymetylu, glukózy, glycerínu a na-triumlaurylsulfátu s redestilovanou vodou,riedidlo sa odstředí pri otáčkách 10 000min.-1 a přidává sa v množstve 5 ml na 1inseminačnú dávku, ochladí sa na 5 °C, pri-čom sa do riedidla přidá glycerín s podie-loim 2 % hm. a týmto' sa dorieďuje po kvap-kách v množstve 5 ml na 1 inseminačnúdávku za stálého miešania, po ktorom sazmrazuje v suchom l'ade a tekutom dusíku.

Množstvo riedidla na predriedenie kon-centrovanej spermy sa vypočítá podlá vzta-hu

π (O X A X Kj — P R - g pričom R — počet dávok O — objem čerstvého ejakulátu použitéhona odstredenie Á — aktivita v % čerstvého ejakulátuK — koncentrácia v tis. spermií čerstvého ejakulátu P — percento pathologických spermií

Zmrazovanie sa vykonává na suchom la-de, v ktorom sa predtým vyhlbili jamky napilulky, pričom nakvapkávanie sa vykonává na velkosť 0,2 ml. Po zmrazení sa pilulkypresypú do tekutého dusíka, kde móžu byťskladované neobmedzene dlhú dobu. Před použitím sa pilulky rozmrazia v roz-mrazovacej tekutině, ktorá sa připraví roz-puštěním chelatonu IV, glukózy, hydrouhli-čitanu sodného a citrátu sodného v redesti-lovanej vodě pri 38 °C. Na rozmrazenie jed-nej inseminačnej dávky, t. j. 50 piluliek sapoužije 70 ml rozmrazovacej tekutiny 50 °Cteplej. Výhodou navrhovaného spósobu podlávynálezu je, že umožňuje spracovanie, kon-zerváciu a uskladnenie kančej spermy smožnosťou rozmrazovania pri výkone inse-minácie prasnic, čo umožňuje využívať in-semináciu ošípaných bez časového a prie-storového obmedzenia tak, ako je to u ho-vadzieho dobytka. Přitom dosiahnuté výsled-ky plodnosti zmrazenou spermou předsti-huji! výsledky plodnosti dosiahnuté čerst-vou spermou. Zmrazovanie spermy umožňu-je podstatné zdokonalenie realizácie pripa-rovania a tým i uplatnenie dosial' nemož-ných metod plemenitby a šlachtenia ošípa-ných. V nasledujúcej časti je vynález objasně-ný príkladom přípravy ejakulátu před zmra-zovaním a insemináciou, ktorým sa samo-zřejmé jeho rozsah nevyčerpáva, ani inakneobmedzuje. Příklad prevedenia

Ejakulát odobratý ručnou metodou do500 ml skleněného odběrného valca umiest-neného v umelej vagíně vytemperovanejteplou vodou v plášti vagíny na 37 °C sapreleje cez dvojitý filter sterilnej gázy doodmerného valca o obsahu 500 ml. Z množstva získaného ejakulátu sa odo-berie 10 ml pre účely laboratórneho vyše-trenia. Sperma v odmernom válci sa pone-chá odstát 30 až 60 min., čo je ekvilibračnádoba, pri laboratórnej teplote. Počas tejtodoby sa prevedie laboratorně vyšetřeme e-jakulátu. Zistí sa pH acidimetrom, pričomhodnoty majú byť v rozmedzí 6,8 až 7,2. Ak-tivita sa zistí mikroskopicky, najnižšia hod-nota 70 %. Koncentrácia sa zistí fotokolo-rimetricky, alebo na Burgerovej komorke;najnižšia hodnota 250 tis. na ml. Morřolo-gické změny sa zistia metodou podlá Farel-lyho, přípustné morfologické změny sú do20 %, z toho nezrelých spermií s protoplaz-matickou kvapkou do 10 °/o. Ďalej sa připraví riedidlo, ktoré pozostá-va z TES—N—TRIS (hydroxymetyl, metyl-2-ami-noetan, kyselina sírová) v množstve 1,1 g TRIS (hydroxymetyl, aminoetan) v množ-stve 2,2 g glukózy 3,2 g glycerolu 3 °/o, t. j. 3,3 g vaječného žítku 22 ml natrium-lauril-sulfátu 0,5 ml natriumlaurylsulfátu 0,5 ml

Claims (1)

1. Riedidlo sa připraví tak, že vaječný žítokpo přidaní 10 ml redestilovanej vody sa ho-mogenizuje mixerom po dobu 5 min. Medzitým sa ďalšie komponenty: TES—N—TRIS,TRIS a glukóza rozpustia v 50 ml redesti-lovanej vody 40 °C teplej. Po rozpuštěníkomponentov a dókladnej homogenizácii sažítok vleje do rozpuštěných častí riedidla.Po premiešaní sa obsah doplní redestilova-nou vodou 35 °C teplou na 100 ml. V dal-šom sa přidá 0,5 ml natriumlaurylsulfátu a3,3 ml glycerínu. Takto připravené riedidlosa odstreďuje v skúmavkách s obsahom 8mililitrov na odstredivke po dobu 8 min. priotáčkách 10 000 min.-1. Po odstředění satekutý obsah riedidla preleje do odmerné- < ho valca s obsahom 150 ml, sediment sa zo skúmaviek odstráni a v ďalšom sa nepo-užívá. “ Po uplynutí ekvilibračnej doby sa ejaku- lát v odmernom válci premieša a rozdělí sado skúmaviek s obsahom 12 ml a odstreďu-je sa na odstredivke bežne používanej prizisťovaní tukovosti mlieka pri otáčkách1375 min.-1 po dobu 20 min. Můžu sa po-užit i otáčky 2800 až 3000 min."1 po dobu5 min. Po odstředění sa semenná plazma zoskúmaviek odsaje a v skúmavke ostane čis-tá koncentrovaná sperma. Teplote spermysa prisposobí i teplota riedidla, ktoré sa dojednotlivých skúmaviek přidá po kvapkáchza stálého miešania v množstve vypočíta-nom podlá vzorca (O X A X Kj — PR ~ 5 Na jednu inseminačnú dávku sa použije5 ml riedidla. Po ukončení predriedenia sa predriedenásperma vleje do flakonu určeného pre in-semináciu ošípaných a takto připravená savloží do vodného kúpela tak, aby teplotakúpela a predriedenej spermy bola rovna-ká. Schladzovanie prebieha postupné v chladničke, ktorá je nastavená na teplotu+5 °C. Schladzovanie na uvedenú teplotutrvá 90 až 120 min. Zároveň sa připraví zostávajúcej časti riedidla množstvo na do-riedenie po schladení. Použijú sa tie množ-stvá riedidla, ktoré boli použité na predrie-denie. Do připraveného množstva riedidlasa přidá glycerín podielom 2 % hm., t. j.3,3 ml a dobré premiešané sa vloží dochladničky k schladeniu na +5 °C. Po schladení predriedenej spermy a rie-didla sa pristúpi k dorieďovaniu, ktoré sarobí postupné po dvoch až troch kvapkáchpomocou pipety za stálého miešania. Najednu inseminačnú dobu sa použije 5 mlriedidla na doriedenie. Po doriedení sa i-hneď zmrazuje. Zmrazovanie prebieha v suchom lade, vktorom sa vyhíbili jamky na pilulky. Na-kvapkávanie sa vykonává pipetou na vel-kost 0,2 ml. Zmrazovanie na suchom ladetrvá 7 min. Po zmrazení sa pilulky presypúcez lievik do masťoviek, v ktorých je teku-tý dusík. Takto zmrazená sperma sa usklad-ňuje v kontajneroch, kde může byť sklado-vaná v tekutom dusíku neobmedzenú dobu. K rozmrazovaniu piluliek před inseminá-ciou sa použije rozmrazovacia tekutina, kto-rá sa připraví rozpuštěním chelatonu IVv množstve 1,2 g, glukózy v množstve 60 g,hydrouhličitanu sodného v množstve 0,40 ga citrátu sodného v množstve 1,5 g v 1000mililitrov redestilovanej vody pri teplote38 °C. Jedna inseminačná dávka představuje 50piluliek, ktoré sa vyberú z kontajnera a ne-chajú sa odpařit po dobu 60 až 90 sek. Poodpaření sa pilulky postupné vysypú dorozmrazovacej tekutiny ohriatej na 50 °C aobsahu 70 ml. Rozmrazovacia tekutina jeohrievaná priamo vo flakone vo vodnejkúpeli. Takto připravená inseminačná dáv-ka sa ihned' použije k inseminácii. PREDMET Sposob zmrazovania kančej spermy v te-kutom dusíku vyznačujúci sa tým, že sa o-dobratý ejakulát pri teplote 37 °C přefiltru-je, nechá sa odstát na dobu 30 až 60 min,po ktorej sa rozdělí do skúmaviek a odstre-ďuje sa pri otáčkách 2800 až 3000 min"1 podobu 5 min, po ktorých sa semenná plazmaoddělí a čistá koncentrovaná sperma sapredriedi riedidlom, připraveným homoge-nizáciou vaječného žítka, TES—N—TRIS po-zostávajúceho z hydroxymetylu, metyl-2--aminoetanu, kyseliny sírovej, TRIS pozo- VYNALEZU stávajúceho z aminoetanu a hydroxymetylu,glukózy, glycerínu a natriumlaurylsulfátu sredestilovanou vodou, riedidlo sa odstředípri otáčkách 10 000 min"1 a přidává sa vmnožstve 5 ml na jednu inseminačnú dáv-ku, ochladí sa na 5 °C, pričom sa do riedi-dla přidá glycerín s podielom 2 % hm. atýmto sa dorieďuje po kvapkách v množ-stve 5 ml na jednu inseminačnú dávku zastálého miešania, po ktorom sa zmrazuje vsuchom lade a tekutom dusíku.