CS231749B1

CS231749B1 - Analog vasopresinu a způsob jeho výroby

Info

Publication number: CS231749B1
Application number: CS830182A
Authority: CS
Inventors: Frantisek Brtnik; Tomislav Barth; Linda Servitova; Ivan Krejci; Bela Kupkova; Alena Machova; Karel Jost; Jana Skopkova; Pavel Hrbas
Original assignee: Frantisek Brtnik; Tomislav Barth; Linda Servitova; Ivan Krejci; Bela Kupkova; Alena Machova; Karel Jost; Jana Skopkova; Pavel Hrbas
Priority date: 1982-11-19
Filing date: 1982-11-19
Publication date: 1984-12-14

Description

Předmětem vynálezu je analog vasopresinu a způsob jeho výroby. Jedná se o analog stabillsovaný vůči enzymatickému Štěpení a s odstraněným glycinamidovým zbytkem v poloze ', 9, který má významné účinky na centrální nervový systém.

Je známo, že neurohypofysární hormony a některé jejich analogy ovlivňují pamět, spánek a učení u pokusných zvířat (D. de Wied: Proč. Roy. Soc. B210. 183/1980)’. Pro praktické použití je ověem nutné, aby používané látky jednak neměly endokrinní aktivity přírodních hormonů (srovnej a. o. 217633; a. o..230 315), jednak aby byly chráněny vůči enzymatickému Štěpení (Hauzer K., Barth T.: Chem. listy 74. 1029/1980).

Nyní bylo zjištěno, že uvedené požadavky splňuje analog podle vynálezu, který ve srovnání s přírodním hormonem má odstraněný glycinamidový zbytek v poloze 9, L-arginin vpoloze 8 je zaměněn za stereoisomerní formu a disulfidová vazba za vazbu thioÁterovou.

Podstatou vynálezu je analog vasopresinu vzorce I

CHs-CHs-S-CH_O ² 2 ,2

CHg-CO-Tyr-Phe-Gln-Asn-NH-CH-CO-Pro-D-Arg (I) kde všechny aminokyseliny jsou L-řady s výjimkou argininu, který má konfiguraci D. Tyr značí zbytek tyrosinu, Phe zbytek fenylalaninu, Gin zbytek glutaminu, Asn zbytek asparaginu, Pro zbytek prolinu a Arg zbytek argininu.

Podstatou způsobu výroby nového analogu vasopresinu vzorce I podle vynálezu je, že se z peptidu obecného vzorce II

CHs-CHs-S-CH, ^{2 2} t ²

C H₂-CO-Tyr-Phe-Gln-A sn-NH-C H-CO-Pro-Arg/X/-Y (II) kde všechny aminokyseliny jsou L-řady s výjimkou argininu, který má konfiguraci D a kde X značí chránící skupinu postranního řetězce argininu a Y chránící skupinu karboxyskupiny argininu, odštěpí tyto chránící skupiny známým způsobem.

Analog vzorce I působil inhibičně na presorickou aktivitu lysinvasopresinu při stanovení na despinalisované kryse. Antidiuretická aktivita, stanovená na anestetisované kryse, činila 0,8 m. j./mg. V testu na neanestetisované kryse měla látka I antidiuretickou aktivitu o 4,5 až 5 řádů nižší než odpovídající analog, u kterého je glycinamidový zbytek zachován (o. o. 171787); tento údaj je stanoven na základě ekvipotentních dávek (T,/2 ^{= 200} minut) Škopková J., Hrbas P., Slaninová J., Barth T.: Collection Czechoslov. Chem. Commun. 46, 1850/ 1981). Účinek na centrální nervový systém byl zkoušen v testu pasivní obranné reakce (tzv. pasivní vyhýbání). V tomto testu se jevila látka I podle vynálezu výhodnější než látky dříve popsané (a. o. 217633, a. o. 230315).

Způsob výroby analogu podle vynálezu se objasňuje v příkladu provedení.

Příklad

Příprava výchozích sloučenin (meziproduktů). ?

Příprava benzylesteru o-nitrobenzensulfenylprolyl-N -p-toluensulfonyl-D-argininu.

Roztok 2,4,5-trichlorfenylesteru o-nitrobenzensulfeny lprolinu (2,5 g) a hydrobromidu benzylesteru N^G-p-toluensulfonyl-D-argininu (2,5 g) v dimetylformamidu (5 ml) byl míchán 40 h za laboratorní teploty. Dimetylformamid byl odpařen za vakua, odparek rozpuštěn v etylacetátu, etylacetétový roztok extrahován nasyceným roztokem kyselého uhličitanu sodného, vodou, roztokem KHSO^/l^SO^ o pH 2 a vodou. Po vysušení MgSO , odpaření etylacetátu a krystalisaoi z etylacetátu a petroleteru byl, získány 3 g (90%) produktu o t. t. 90 až 92 °C, DG _B -40,4° (c 0,4 metanol); Hy 0,88 (S1), 0,75 CS2), 0,75 (S3), 0,83 (S4),

0,60 (S9). Pro C₃₁H₃₆»₆3₇S₂ (668.8) vypočteno: 55,67% C, 5,43% H, 12,56% N, 9,59% S; nalezeno: 55,92» C, 5,38% H, 12,68% JS, 9,38% S.

Příprava benzylesteru laktamu tyrosyl-fenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S/_y -karboxypropyl/cysteiioyl-prolyl-N^G-p-toluensulfonyl-B-argininu (látka vzorce II).

K roztoku chráněného benzylesteru popsanému výše (177 mg) v dimetylformamidu (1 ml) byl přidán 2,6M chlorovodík v éteru (1 ml) a reakční směs ponechána 4 min. při laboratorní teplotě, vzniklý hydrochlorid byl vysrážen éterem a vysuěen (Eg¹^ = 0,96, Ε^γ = 0,70).

K roztoku hydrochloridu v dimetylformamidu (1 ml) byl přidán N-etylpiperidin tak, aby pH bylo přibližně 10 a byl k němu přilit roztok kyseliny 1-deamino-1-karba-pressinové (Brtník i'., Barth T., Jošt K.: Collect. Czechoslovak. Chem. Commun. £6, 278 /1981/) (100 mg) a N-hydroxybenztriazolu (23 mg) v dimetylformamidu (1,5 ml). Reakční směs byla ochlazena na -30 °C, přidán dicyklohexylkarbodiimid (31 mg) v dimetylformamidu (0,5 ml) a směs byla míchána 4 h při -5 °C a 20 h při pokojové teplotě. Dicyklohexylmočovina byla odfiltrována, di.metylformamid odpařen, odparek protřen kyselinou chlorovodíkovou (pH 2), na filtru promyt vodou, nasyceným roztokem hydrogenuhličítanu sodného, vodou a éterem. Bylo získáno 160 mg surového produktu, který byl čištěn gelovou filtrací v dimetylformamidu. Efluenty, obsahující čistou látku, byly odpařeny a odparek krystalován z dimetylformamidu a vody. Bylo získáno 100 mg (60%) produktu o t. t. 152 až 154 °C [j3 jj ~ 34,0° (c 0,46 dimetýlformamid); 0,50 (S1), 0,54 (S3), 0,66 (S4)· Aminokyselinová analysa:

Pro 0,98, Arg (0,97, Cys/C^COgH) 0,94, Glu 1,05, A_sp 1,04, Tyr 0,92, Phe 1,08,'

Pro C₅₉H₇₄N₁₂O₁₄S₂ . HgO (1257) vypočteno: 56,36% C, 6,09% H, 13,37% H, 5,10% S; nalezeno 56,52% C, 6,13% H, 13,27% N, 5,09% S.

Příprava konečného produktu

Laktam tyrosyl-fenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-/-karboxypropyl/cysteínyl-prolyl-D-argininu (látka vzorce I)

Roztok látky vzorce II (30 mg) v kyselině trifluoroctové (300 /ul) byl ochlazen na 0 °C, přidána kyselina trifluormetansulfonová (200 /ul) a tioanisol (20 Ml) « ponecháno při téže těplotě 30 min. Reakční směs byla sražena éterem, surový volný laktam odfiltrován, promyt éterem a filtrován přes sloupec anexu v acetótovém cyklu. Efluenty byly lyofilisovány a lyofilisát čištěn beznosičovou elektroforesou (2 500 V, 135 mA), Bylo získáno 6 mg produktu o[,aj _D - 47° (c 0,1 1M kyselina octová); R_p 0,34 (S1), 0,57 (S4), 0,74 (S23); E^ °>⁶⁰· Aminokyselinové složení: Arg 1,01, Pro 1,04, Glu 1,01, Asp 1,02, Phe 0,97,

Tyr 0,94, Cys/CjH^OgH/ 0,98. Pro ^C45^H62^N12^O12^S · CHýJOOH. 3HgO (1109) vypočteno: 50,69% C, 6,54% H, 15,15% N; nalezeno: 50,68% C, 6,45% H, 14,92% N.

Analytické metody použité v příkladu provedení:

Analysy aminokyselin byly prováděny na automatickém přístroji (Vývojové dílny, československá akademie věd, tp. 6020). Vzorky peptidů byly hydrolysovány 20 hodin v 6K-HC1 při 105 °C ve vakuu 150 Pa. Chromatografie v tenké vrstvě byla prováděna na silikagelových deskách (Silufol, Kavalier) v systémech:

: 2-butanoL - 98% HCOOH - HgO (75 : 13,5 : 11,5) : 2-butanol - 2 5% NI^OH ~ HgO (85 : 7,5 : 7,5) : 1-butanol - CHýÍOOH - HgO (40 : 10 : 10) : 1-butanol - CHjCOOH - pyridin - HgO (15=3:10:6)

Ξ9 : benzen s 20 % metanolu

S23 : ětylacetát - pyridin - CH^COOH - HgO (5:5:1 : 3)

Elektroforetická analysa byla prováděna na papíru Whatman 3MM ve vlhké komůrce při potenciálovém spádu 20 V/cm. Látky byly detekovány ninhydrinem nebo chlorační metodou.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Analog vasopresinu vzorce I

CHó

-OHs

-CH~ “2 2 ® ,2 l I

CHg-CO-Tyr-Phe-Gln-Asn-NH-CH-CO-Pro-D-Arg (I) kde všechny aminokyseliny jsou L-řady s výjimkou argininu, který má konfiguraci D.
2. Způsob výroby nového analogu vasopresinu vzorce I podle bodu 1 vyznačený tím, že se z ýeptidu obecného vzorce II

CHr

CHj—S-6H_? t

CH₂-CO-Tyr-Phe-Gln-Asn-NH-CH-CO-Pro-D-Arg/X/-Y (II) kde všechny aminokyseliny jsou L-řady s výjimkou argininu, který má konfiguraci D a kde X značí chránící skupinu postranního řetězce argininu a Y chránící skupinu karboxylové skupiny argininu, odštěpí tyto chránící skupiny.