CS231660B1 - Způsob imobilizace ligátu pro saturační analýzu - Google Patents

Abstract

Vynález spočívá v tom, že ligát imobilizuje prostřednictvím koordinační vazby na nosný materiál aktivovaný hydroxidy kovů vytvářejících koordinační vazby. Jako nosný materiál se používá porézní sklo, případně skleněné destičky nebo tyčinky s povrchem upraveným působením kyseliny nebo alkálií nebo upraveny pouhým zdrsněním, např. zbroušením. Vlastni separace volného a vázaného , ligantu spočívá v případě nosiče o malých částicích v sedimentaci těchto částic s navázaným ligandcm, v případě nosi- - če větších rozměrů v pouhém vyjmuti nos- ■ ného materiálu z rostoku. Vynález je možno využít pro vysoce citlivou a specifickou analýzu, peptidů, hormonů, vitamínů, steroidů, alkaloidů, pesticidů, toxinů a pod.

Description

Vynález se týká způsobu imobilizace ligátu pro saturační analýzu.

Saturační analýza je analytický postup, který využívá principu specifické vazby různých látek například hormonů, vitamínů, steroidů, enzymů, alkaloidů, pesticidů a antigenů na určitou, pro tyto látky specifickou bílkovinu. Stanovení je založeno na soutěžení ligandů, což je stanovovaná látka, přítomná ve vzorku a tatáž přidaná látka značená například radionuklidem nebo fluorescenčním Činidlem, ve vazbě na ligát, což je specifická látka, například bílkovina. Podle uspořádání analytického postupu mohou být ligandem nebo ligatem bílkoviny, peptidy, hormony, vitaminy, steroídy, alkaloidy, pesticidy, toxiny.

Po separaci vázaného ligandu od nevázaného se dá změřením radioaktivity, fluorescence či jiné veličiny přímo určit koncentrace stahovené látky ve vzorku. Metoda saturační analýzy je vysoce specifická a látky lze stanovit v koncentracích řádu nmolů až fmolů.

K separaci volného a vázaného ligandu je používána celá řada metod, například adsorpce volného ligandu na vhodný adsorbent /'aktivní uhlí, silikagel aj./, vysrážení ligátu s vázaným ligandem organickými rozpouštědly, anorganickými solemi apod. Jelikož je vazba ligát - ligand reversibilní povahy, je u těchto metod nebezpečí porušení rovnováhy volný - vázaný ligand.

Značného zjednodušení separace volného a vázaného ligandu je možno dosáhnout tím, že se ligát imobilizuje na nosič. Nejjednodušší formou imobilizace je adsorpce na stěny reakční nádobky.

231 660

Vazebná bílkovina ae nejčastěji adsorbujp^lyatyrénové^zku- ; mavky nebo na mikrotitrační destičky ž“téhož mjrteri^lu^-AdsflCfiční síly, které drží vazebnou bílkovinu na povrchu nosiče, jsou však poměrně slabí» a imobilixace je proto mnohdy nedostatečná. Rovněž nízký titr vazebné bílkoviny může ještě dále zhoršit výsledný efekt. Z uvedených důvodů se vazebná bílkovina někdy zasíťuje na povrchu nosiče různými bifunkčními Činidly anebo ještě častěji se imobilizuje kovalentní vazbou přímo na aktivovaný nosič.

K imobilixaci ligétu kovalentní vazbou bylo použito řady materiálů jako např. celulózy aktivované bromkyanem, polymerů obsahujících aktivní ixothiokyanátové skupiny, ‘částic vytvořených polymerací postyrenového latexu a glycidylmethakrylátem a styrenem, částic vytvořených polymerací celulózy, akroleinu a oxidů železa apod. K imobilixaci ligátů kovalentní vazbou bylo též použito skla aktivovaného lA -aminopropyltriethoxysilanen^ případně hydroxysukcinimidem. *

Způsob imobili’ace pro saturační analýzu podle vynálezu spočívá v tom, že se ligát imobilizuje prostřednitvím koordinační vazby na nosič, aktivovaný hydroxidy přechodových kovů, vytvářející koordinační vazby. Jako nosiče lze použít sklo s vhodně upraveným povrchem, který se aktivuje solemi kovů, s výhodou chloridem titánitým nebo chloridem titaničitým s následující hydrolýzou za tvorby komplexních hydroxidů tranzitních kovů. Po vnesení takto aktivovaného skla do roztoku ligátu dochází k jeho imobili^aci na povrchu nosiče prostřednictvím koordinační vazby.

Povrch skla se před aktivací solemi kovů upravuje leptáním kyselinou fluorovodíkovou, chlorovodíkovou či jinými kyselinami, hydroxidem sodným či jinými alkáliemi nebo s výhodou prostým zdrsněním povrchu skla, například broušením. V případě použití porézního skla není tato úprava nutná.

Výhodou tohoto způsobu je vedle experimentální jednoduchosti imobili^ace ligátu i zjednodušení vlastní separace volný - vázaný ligand. V případě použití malých částic skla dochází k jejich rychlé sedimentaci, takže odpadá pro jiné materiály běžně nutná

231 ΒβΟ centrifugace. U skel ve formě destiček nebo tyčinek spočívá celá separace v pouhém vyjmutí nosiče s navázaným ligandem z inkubačního roztoku. V obou případech se navíc vylučuje porušení rovnováhy volný - vázaný ligand, ke kterému může dojít při použití ji ných technik. Je možno pracovat i s vazebnou bílkovinou nízkého titru, jelikož imobiliaací koordinační vazbou je dosaženo jejího efektivního navázání a využití.

Vynález je dokumentován příKlady.

Příklad 1

K 12,5/0 roztoKU chloridu titanitého v kyselině chlorovodíkové bylo přidáno porézní sklo v poměru 1 g na 20 ml a reakční směs třepána 20 min. při 40°C. Po odstranění supernatantu byl odsátý pevný podíl sušen 6 h při 45°G, potw byl promyt vodou /6 x objemem reakční směsi/ a opět vysušen při 45°C během 6 h*

K aktivovanému poréznímu sklu bylo přidáno antisérum proti papainu. Po 16 h mírného třepání při 4°C bylo porézní sklo s navázanou protilátkou promyto 0,1 lí fosfátovým pufrem pH 7,4 a použito ke stanovení papainu. Papain byl stanovitelný v rozmezí 80 až 2 000 ng/ml.

Příklad 2

Skleněné destičky o rozměru 10 x 4 x 1 mm byly zahřívány při 11O°C po dobu 5 h v 20,4%> kyselině chlorovodíkové, potGflbyly promyty vodou a aktivovány postupem podle příkladu 1. K aktivovaným skleněným destičkám bylo přidáno antisérum proti papainu. Po 16 h mírného třepání při 4°0 byly destičky promyty 0,1 12 fosfátovým pufrem pH 7,4 a použity ke stanovení papainu. Papain byl stanovitelný v rozmezí 80 až 2 000 ng/ml.

PříKlad 5

Skleněné tyčinky délky 10 mm a průměru 5 mm byly zahřívány za varu po dobu 5 h v roztoku 1 M hydroxidu sodného a 1 12 uhličitanu sodného. Následující postup stanovení papainu byl shodný jako v příkladu 2. Papain byl stanovitelný v rozmezí 80 až 2 OGu ng/ml.

Příklad 4

231 660

Skleněné tyčinky délky 10 mm a průměru 3 mm byly povrchově upravovány působením 5% kyseliny fluorovodíkové při 20 °C po dobu jako v příkladu 2. Papain byl stanovitelný v rozmezí 120 až 2 000 ng/ml.

Příklad 5

Povrch skleněných destiček o rozměru 10 x 4 x 1 mm upravený broušením byl aktivován postupem jako v příkladu 1. K aktivovaným destičkám bylo přidáno antisérum papainu. Po 16 h mírného třepání při 4 °C a následujícím promytí 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7,4 byl stanoven papain v rozmezí 80 až 2 000 ng/ml.

Příklad 6

Chitinový prášek byl aktivován postupem jakcív příkladu 1.

K aktivovanému chitinu bylo přidáno antisérum proti papainu. Reakční směs byla mírně třepána 8 h při teplotě 4 °G. PotzMjbyl chitinový prášek 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7,4 a použit ke stanovení papainu. Papain byl stanovitelný v rozmezí 120 až 2 000 ng/ml.

Příklad 7

Povrch sorsilenu byl aktivován postupem jako v příkladu 1.

K aktivovanému sorsilenu bylo přidáno antisérum proti papainu. Reakční směs byla inkubována za mírného třepání 24 h při teplotě 4 °C. Potem byl sorsilen promýt 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7,4 a použit ke stanovení papainu. Papain byl stanovitelný v rozmezí 200 až 2 000 ng/ml.

Příklad 8

K 5 g skla /porézní sklo, skleněné destičky/ se přidá 50 ml 12,5% SnCl^ v koncentrované HC1 a nechá se 20 minut třepat při 40 °C. Pak se odsaje a suší 6 h při 45 °C v termostatu. Usušené aktivované sklo se 6krét promyje vždy 100 ml vody a nakonec se usuší při 45 °C. Další postup je stejný jako u příkladu 1 a 2. Papain byl stanovitelný v rozsahu od 200 do 2 000 ng/ml.

Claims (6)

1. Způsob imobilizace ligátu pro saturační analýzu při stanovení biologicky účinných látek separací volného a vázaného li^andu na základě soutěžení ligandů stanovované látky a téže látky značené například radionuklidem, fluorescenčním činidlem či enzymem, ve vazbě na ligát, například specifickou vazebnou bil kovinou, vyznačující se tím, že se ligát imobilizuje prostřednictvím koordinační vazby na nosič aktivovaný hydroxidy přecho dových kovi} vytvářející koordinační vazby.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako nosiče použije skla, jehož povrch se upraví působením kyselil} s výhodou kyselinou chlorovodíkovou nebo fluorovodíkovoi) a takto upravený povrch se aktivuje solemi kovfy například chloridem titanitým nebo titaničitým s následující hydrolýzou.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako nosiče použije skla, jehož povrch se upraví působením hydroxidu sodného či jiných alkálií, případně v kombinaci s uhličitany alkalických kovů, a takto upravený* povrch se aktivuje solemi kovů s následující hydrolýzou.

4« Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako nosiče použije skla, jehož povrch se upraví zdrsněním,s výhodou broušením, a takto upravený povrch se aktivuje solemi kovů s následující hydrolýzou.

5. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako nosiče použije porézního skla, jehož povrch se aktivuje solemi kovů s následující hydrolýzou.

6. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako nosiče použijí přírodní nebo syntetické polymery, například chitin a sorsilen.