CS231402B1 - Způsob výroby penicilinu G nebo V - Google Patents

Abstract

Vynález se týká způsobu výroby pěni-, cilinu G nebo V ze plynulého dávkování sacharidů v závislosti na pH.

Description

Vynález se týká způsobu výroby penicilinu G nebo V, kultivaci produkčního mikroorganismu za submerzních podmínek, v tekuté živné půdě, obsahující zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku, minerální živné soli a prekursory.

Výrobě penicilinů, a to jak penicilinu G, tak i penicilinu V, jako nejdůležitějšim antibiotikům, je stále věnována značná pozornost, která je především zaměřena na ekonomizaci výrobního procesu, zejména na jeho fermentační část.

Maximálního efektu se snaží různí výrobci dosáhnout použitím speciálně šlechtěných vysokoprodukčních izolátů nebo s daným izolátem pomocí fermentace zaměřené na nejhospodárnější suroviny.

Zásadně však platí, že pro vlastní fermentaci a pro optimální podmínky produkčních kmenů musí základní živná půda obsahovat optimální množství asimilovatelných zdrojů uhlíku a dusíku, kromě dalších specifických látek a prekurzorů.

V odborné literatuře i v patentních spisech je popsáno mnoho způsobů fermentační výroby penicilinu, týkajících se použiti koncentrací a kombinací různých surovin, různých podmínek technologie, jako i šlechtění a výběru vysokoprodukčních kmenů. I při výrobš s kmenem daných vlastností je však možno dále vhodnými úpravami technologie a vhodnou volbou surovin dosáhnout maximálních výtěžků a hospodárnosti procesu.

Základním typem fermentačních surovin je systém kukuřičný výluh - laktóza, popisovaný v různých kombinacích. Kukuřičný výluh bývá nahrazován arašídovou moukou, sójovou moukou, bavlníkovým semenem apod. Laktóza jako zdroj uhlíku je nahrazována např. glukózou nebo sacharózou.

Použití těchto cukrů zvyšuje sice hospodárnost procesu a umožňuje řídit přímo spotřebu cukru v průběhu fermentace, značně se však ztěžuje technologické vedení, poněvadž je nutno přizpůsobovat vhodná dávkovači zařízení a nepřetržitě přesně kontrolovat fermentační proces.

Studiem fermentaci s lehce asimilovatelnými zdroji uhlíku se zabývá řada prací (<J. Noguchi se sp., Nippon-Nogei-kagaku Kaishi 10, 511, /1955/), srovnávajících např. výtěžnost při použití laktózý a glukózy nebo popisujících fermentaci při pomalém přidáváni zdrojů uhlíku, tj. glukózy, sacharózy, melasy a laktózy (A. Serzedello, Bolí. ins. zimotec. /Sao Paolo/ 15, 3, /1956/) nebo náhradu laktozy nebo glukózy sacharózou (M. J. Thirumalachar,

K. S. Gopalkrishnan, v knize Antibiotics, their production, utilization and mode of action, Symposium Pimpri, 1956).

Mechanismus biosyntézy penicilinu s přihlédnutím k použití laktózy, resp. sacharózy byl rovněž sledován v řadí prací A. Balilo, Bolí, soc. Ital. biol. sper. 31, 1 338, (1955), ref. Chem. Abstr. 50, 11 430i, (1956)} E. Gosh, Hind, Antibiot. Bull. 1, 59, (1958), ref. Britlsh Abstr. 33, 30 605, (1959); V. N, Besphende, K. Ganapathi, J. Sci. Hesearch (India) 17C, 59, (1958), ref. Chem. Abstr. 53, 14 6811, (1959); J. I. Hoshan, K. Ganapathi, Nátuře 183, 758, (1959)].

Vliv rychlosti asimilace cukrů na produkci sledovala N. M. Nerotiova (Mikrobiologija 27, 687, /1958/), použili kukuřičného škrobu jako zdroje uhlíku popsal L. Yu se sp. (Cem. Abstr. 53, 18376h, /1959/).

Záklední význam má však postup publikovaný F. V. Solterem a M. J. Johnsonem (Appl. Microbiol. 2, 41, /1954/), při kterém se používá jako zdroje lehce asimilovatelného uhlíku sacharózy, přidávané stále stejnou,rychlostí k fermentační půdě.

Druhý základní princip (US pat. spis č. 2830934) spočívá v tom, že se na začátku bio3 syntézy penicilinu vychází z půdy, prosté zdrojů asimilovatelného uhlíku, které se potom přidávají pouze v průběhu fermentace (glukóza, sacharóza, melasa) takovou rychlostí, která se rovná rychlosti spotřeby laktózy v pokuse, probíhajícím paralelně za stejných podmínek. )

Z citovaných postupů jen poslední dva mají zásadní význam a lze je aplikovat v provozním měřítku.

Při jejich ověřování vSak bylo zjištěno, že při rovnoměrném přívodu sacharózy v prvém případě dochází v některých fázích fermentace k jejímu předávkování, v jiných fázích opět k nedostatečnému dávkování, což se v obou případech projevuje nepříznivě v metabolismu produkčního mikroorganismu a v souvislosti s tím i ve snížení produkce, v porovnání s kontrolní fermentací s laktózou.

Pro dosaženi produkcí srovnatelných s kontrolní laktózovou fermentací bylo zapotřebí neúměrně vysokého množství sacharózy. Při ověřování druhého postupu, který je v porovnání s prvým postupem o něco výhodnější, bylo zjištěno, že průběh metabolismu při použití laktózy a sacharózy je podstatně odlišný a že není možno se při dávkování sacharózy řídit schématem spotřeby laktózy.

Při srovnáni tohoto postupu s kontrolní laktózovou fermentací vyšly najevo znaěné výkyvy v produkci, i když celková spotřeba sacharózy odpovídala spotřebě laktózy.

Bylo zjištěno, že nevýhody dosavadních způsobů lze odstranit podle vynálezu při způsobu výroby penicilinu G nebo V, kultivací produkčního mikroorganismu za submertních podmínek, v tekuté živné půdě., obsahující zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku, minerální živná soli a prekurzory, s kontinuálním nebo semikontinuálnim přidáváním zdrojů asimilovatelného uhlíku, zejména sacharózy.

Podstata tohoto způsobu spočívá v tom, že se veškerá sacharóza přidává do základní živné půdy, prosté cukrů, po naočkování produkčním mikroorganismem, takovou rychlosti, aby se hodnota pH půdy udržovala v průběhu fermentace v rozmezí 6,5 až 7,5, a výhodou v rozmezí 7,0 až 7,4.

Lze postupovat táž tak, že se k základní živné půdě, obsahující nejméně 20 % celkového množství použitých zdrojů asimilovatelného dusíku, přidává zbývající část celkového množství použitých zdrojů dusíku současně se sacharózou.

Při provedení způsobu podle vynálezu je indikátorem optimální spotřeby sacharózy hodnota, která je pro určitý produkční kmen nejvhodnější. Při přebytku sacharózy je metabolismus podstatně rychlejší, hodnota pH půdy klesá, dochází k poruše metabolismu, až ke stagnaci produkce.

Naproti tomu nedostatek sacharózy se projevuje velmi rychle autolýzou qycelia, zvyšováním pH do alkalické Oblasti a zastavením produkce, resp. rychlým úbytkem koncentrace již vzniklé účinné látky.

Vhodná dávkování sacharózy podle průběhu pH půdy při fermentací umožňuje udržovat jeho hodnotu v mezích odchylky o 0,1 až 0,3 od hodnoty optimální.

Začátek fermentace asi do 10. hodiny je přizpůsoben minimální spotřebě sacharózy a dávkování je postupně zvyšováno tak, že maxima jeho rychlosti je dosaženo mezi 30. a 60. hodinou kultivace.

Sacharózu je možno přidávat některým běžně známým postupem st už kontinuálně nebo ve velmi krátkých intervalech. Rychlost dávkování se obvykle mění podle potřeby v 5 až 20hodl231402 nových intervalech. Při dodržování dávkování sacharózy způsobem podle vynálezu je možná s daným produkčním kmenem dosáhnout maximální produkce, poněvadž jsou vytvořeny optimální podmínky pro růst a produkci v jednotlivých fázích fermentace.

Pro daný produkční kmen zůstává schéma rychlosti dávkování sacharózy při fermentacích s normálním průběhem neměnná a je možné potom s výhodou pracovat podle předem určeného pro gramu dávkování.

Další předností tohoto postupu je to, že v mimořádném případě vychýleni pH z optimální oblasti (např. při změněné rychlosti růstu kultury) je indikován současně nedostatek nebo přebytek zdroje uhlíku a okamžitým zásahem do dávkování je možno upravit jak optimální koncentraci živin tak i hodnotu pH do vyhovující oblasti.

Zpočátku je fermentace vedena tak, aby optimální pH prostředí pro produkci bylo dosaženo ve 20. až 30. hodině kultivace. Tak vzniká vlastní schéma spotřeby sacharózy, které je shodné se schématem rychlosti jejího dávkování.

Toto schéma se ovšem podstatně liší od schématu spotřeby laktózy. Vlastní průběh fermentace je potom maximálně ekonomický a ve srovnání s laktózovým postupem je spotřeba sacharózy za přibližně stejnou dobu refmentece až o 20 95 nižší a produkce naproti tomu při použití stejného produkčního kmene, za stejnou kultivační dobu a za stejných kultivačních podmínek, je až o 30 95 vyšší.

Dále bylo zjištěno, že je možné pro zvýšení výtěžků v prodloužené kultivační době použít takového postupu, při kterém se současně se sacharozou dávkuje do půdy též zdroj snadno asimilovatelného dusíku, s výhodou rozpustného ve vodě (např. kukuřičný výluh, močovina, dusičnan sodný atd.).

Přitom základní živná půda obsahuje pouze část celkového množství zdrojů dusíku a zbývající část se přidává k půdě v průběhu fermentace.

Přikladl

Produkční živné půda měla složení: 2 % kukuřičného výluhu, 2 95 srašidové moučky,

0,7 95 uhličitanu vápenatého, 0,3 % síranu sodného a 0,25 95 kyseliny fenoxyoctové. Po sterilizaci měla půda pH 6,5.

Po naočkováni 1 0 95 inokuln produkčního mikroorganismu bylo zahájeno dávkování 5095 roz· toku sacharózy (hmotnost, objem) tak, aby hodnota pří se pohybovala kolem hodnoty optimální pro použitý produkční kmen (7,0 až 7,3). Průběh blosyntézy penicilinu V byl tento:

hodina

fermentace	0	10	20	30	40	50
pH	6,5	6,8	6,9	7,0	7,2	7,0
sacharóza
v %/hoč.	0,01	0,02	0,06	0,10	0,09	0,09
j/ml.103	-	- ·	-	-	2,0	2,8

hodina

fermentace	60	70	80	90	100
pH	7,1	7,2	7,2	7,2	7,3
sacheróza
v %/hod.	0,08 .	0,06	0,04	0,04	-
j/ml.íO3	3,9	4,5	5,0	5,4	5,9

Za základ procentuálního složeni půdy a množství přidávané sacharózy byl vzat výchozí objem 35 m³. Konečný objem (+ roztok sacharózy, - odpař a ztráty vzorkováním apod.) byl 37 a³.

Přiklad 2

Složení živné půdy jako v přikladu 1 s tlm rozdílem, že místo kyseliny fenoxyoctové bylo použito celkem 0,35 % fenyloctanu amonného, který byl přidáván v 12hodinových intervalech v 5 dávkách, počínaje 12. hodinou kultivace. Průběh biosyntézy penicilinu O byl tento:

hodina

fermentace	0	10	20	30	40	' 50
PH	6,4	6,7	7,0	7,2	7,4	7,3
sacharóza
v %/hod.	0,01	0,02	0,06	0,10	0,09	0,09
j/ml.103	-	-	-	-	3,1	3,9
hodina	60	70	80	90		100
fermentace
PH	• 7,1	7,2	7,3	7,3		7,3
sacheróza
v %/hod.	0,08	0,06	0,04	0,04		-
j/ml.103	4,3	5,0	5,7	6,4		7,1

Výchozí objem půdy byl 35 a³, konečný objem 36 m³

Přiklad 3

Produkční živná půda mála složení: 1 % kukuřičného výluhu, 1 % arašídové moučky, 0,7 9 uhličitanu vápenatého, 0,3 % síranu*sodného, 0,25 % kyseliny fenoxyoctové.

Po sterilizaci mšla půda pH 6,5. Po naočkováni 10% inokula produkčního kmene bylo zahájeno dávkování roztoku obsahujícího 50 % sacharózy a 15 % sušiny kukuřičného výluhu, a to takovou rychlosti, aby pH se udržovalo kolem optimální hodnoty.

Celkem bylo přidáno 9,2 % sacharózy a 2,75 % sušiny kukuřičného výluhu. Průběh biosyntézy penicilinu V byl tento:

231402 6

Hodina

fernentace	0	to	20	30	40	50	60
pH	6,5	6,7	7,0	7,3	7,4	7,4	7,4
sacharóza
v X/hod.	0,01	0,03	0,08	0,J0	0,10	0,10	0,10
j/al.103		-	-	-	2,0	2,9	3,8
hodina
fernentace	70	80	90	100	1 10	120	130
pH	7,3	7,5	7,4	7,4	7,3	7,5	7,7
sacharóza
v X/hod.	0,08	0,10	0,10	0,04 í	0,04	0,04	-
J/ml.103	4,6	5,1	5,7	5,8	6,4	6,7	7,1

Výchozí objen půdy byl 10 litrů, konečný objem 10,5 litru. '

Příklad 4

Produkční živní půda mšla složení: 2 % kukuřičného výluhu, 0,7 % uhličitanu vápenatého, 0,3 % síranu sodného, 0,25 X fenyloctenu amonného, který byl přidáván v průběhu kultivace podobně jako v příkladu, 2.

Po sterilizaci měla půda pH 6,5. Po naočkování 10% inokula produkčního mikroorganismu bylo zahájeno dávkování roztoku, obsahujícího 50 X sacherózy, 10 % sušiny kukuřičného výluhu a 0,65 % močoviny.

Celkovš přidáno 1 860 ml roztoku, tj. 9,3 X sacherózy, 1,86 X kukuřičného výluhu a z močoviny tolik dusíku, kolik odpovídá-0,93 X sušiny kukuřičného výluhu. Průbšh biosyntézy penicilinu O byl tento:

hodina

fernentace	0	10	20	30	40	50	60
pH	6,5	6,8	7,1	7,3	7,4	7,5	7,4
sacharóza v X/hod.	0,01	0,03	0,09	0,09	0,09	0,10	0,1(	j
j/nl.103		-	-	-	2,8	3,4	3,9
hodina · fernentace	7Ó	80	90	100	110	120		130
pH	7,5Y	7,5	7,4	7,4	7,3	7,5		7,6
sacharóza v X/hod.	0,10	0,10	0,08	0,06	0,04	0,04
j/nl.103	4,5	4,85	5,8	6,9	7,7	7,7'		8,2
Základní množství půdy bylo 10	litrů,	konečné	množství	11 litrů.

Příklad 5

Produkční živná půda měla složení: 2 % kukuřičného výluhu (sušina), 0,7 % uhličitanu vápenatého, 0,3 % síranu sodného a 0,25 % kyseliny fenoxyoctové. Po sterilizaci měla půda pH 6,5.

Po naočkování ,0% inokula produkčního mikroorganismu bylo zahájeno dávkování roztoku obsahujícího 50 % sacharózy, 10 % sušiny kukuřičného výluhu a 0,85 % dusičnanu amonného.

Bylo přidáno celkem 1 720 ml roztoku, tj. 8,6 % sacharózy, 1,72 % sušiny kukuřičného výluhu a z dusičnanu amonného tolik dusíku, kolik odpovídá 0,86 % sušiny kukuřičného výlu hu. Průběh biosyntézy penicilinu V byl tento:

Claims (2)

1. Způsob výroby penicilinu G nebo V, kultivací produkčního mikroorganismu za submerzních podmínek, v tekuté živné půoě, obsahující zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku, minerální živné soli a překurzory, s kontinuálním nebo semikontinuálním přidáváním zdrojů asimilovatelného uhlíku, zejména sacharózy, \yznačující se tím, že se veškerá sacharóza přidává do základní živné půdy, prosté cukrů, po naočkování produkčním mikroorganismem, takovou rychlostí, aby se hodnota pH půdy udržovala v průběhu fermentace v rozmezí 6,5 až 7,5, s výhodou v rozmezí 7,0 až 7,4.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se k základní živné půdě, obsahující nejméně 20 % celkového množství použitých Zdrojů asimilovatelného dusíku, přidává zbývající část celkového množství použitých zdrojů dusíku současně se saoharózou.