CS230888B1 - Sposob produkcie 3-mananázy pomocou mikroskopických húb rodu Lemonniera - Google Patents

Description

230888

Vynález sa týká sposobu produkcie enzý-mu /3-1,4-mari.án manánohydroíázy (/ř-mana-náza, EC 3.2.1.78) pomocou mikroskopickýchhúb rodu Lemonniera kultivovaných navhodných živných podach.

Produkcia enzýmu já-mananázy je zatiafpopisovaná zriedkavo, aj keď je známe, ženiektoré mikroorganizmy majú schopnosttento enzým produkovat. Tak například β--mananázová zložka je obsiahnutá aj v kom-plexnom hemicelulázovom enzýmovom sys-téme, produkovanom mikroskopickými huba-mi rodu Rhizopus (produkt firmy Sigma),Aspergillus niger [Yamazaki, N., Sinner M.,Dietrichs Η. H.: Holzforschung (1976 30, 101)baktériami Xanthomonas campestris (Dek-ker, R. F. H., Canda, G. P.: Arch. Microbiol.(1979 122, 297), resp. slizovkou Physarumpolycephalum (Fr. patent 2385 730)].

Schopnost produkovat tento enzým je všakpodstatné rozšírenejšia než by zodpovedalomalému počtu publikácií obmedzujúcich sana niekofko mikroorganizmov. Pomocou gé-lovej. metody (A.O. č. 186 059) testovaniamikroorganizmov na polysácharid hydrolázyposobiace endomechanizmom v priebehu kul-tivácie zistili sme výraznú produkciu ,/2-ma-nanázovej aktivity u vodných hyfomycetrodu Lemonniera.

Rod Lemonniera patří do čelade Monilia-ceae rodu Moniliales, triedy Deuteromycetes.Zástupcovia tohto rodu patria. medzi vodnéhyfomycetý.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že kulti- váciou nasledovných štyrochLemonniera, a to: kmeňov rodu Lemonniera aquatica CCMF - - 124 Lemonniera centrosphaera CCMF - 149 Lemonniera cornuta CCMF - 325 Lemonniera terrestris CCMF - 125 jednotlivo alebo ich zmesí na živnej půděobsahujúcej čistý ,/3-1,4-manán, alebo jehonerozpustný derivát připravený v reakciisieťovania s 2-chlórmetyloxiránom alebo he-micelulózovú zmes polysacharidov obsahu-júcich /3-1,4-manán pri teplote 15 až 25 °C apH 5,0 až 6,0, s výhodou pH 5,5 po dobu 96až 144 hodin produkuje enzým jS-mananázu,ktorý sa získá v surovom stave odpařenímrastovej pody, připadne v zušfachtenom stavezrážaním síranom amonným alebo organic-kými rozpúšťadlami, s výhodou etanolu aacetonu. K ďalšej purifikácii surového enzýmu β--mananázy po dialýze možno použit afinitnúmetodu za použitia sletovaného manánu (exPhytelephas macrocarpe) ako afinitného li-gandu. Výhodou nového postupu je predovšetkýmto, že příprava β-mananázy je velmi jedno-duchá a ako súčasť kultivačnej pody možnopoužit aj neprečistené nativně substráty typugalaktománov l'ahko dostupné ako rožnedruhy polnohospodárskeho a dřevného od-padu. Ďalšou výhodou je poměrně vysoký výťažok jS-mananázovej aktivity, a to aj prinižších fermentačných teplotách (20 °C).Nakofko uvedené kmene rodu Lemonnieraprodukují popři ,β-mananázovej aktivitě ajďalšie hemicelulázové a celulolytické enzý-mi, ako aj enzými schopné oxidatívne de-gradovat lignin, možno použit tieto kmeneaj ku komplexnej utilizácii drevnej hmotyovšem v podmienkách optimálnych pre ichrozmnožovanie. Příklad 1

Lemonniera aquatica CCMF-124, Lemon-niera centrosphaera CCMF-149, Lemonnieracornuta CCMF-325, Lemonniera terrestrisCCMF-125 sa pomnožia na rastovej pode ob-sahujúcej 1,6 gélu (připraveného sletová-ním /3-1,4-manánu rastlinnej slonoviny (Phy-telaphas macrocarpe A. O. č. 186 059) pono-řeného do polovice výšky do Yeast Ni-trogen Base rastovej pody (0,6 g/100 ml)]o pH 5,5 a kultivuje sa na povrchu po dobu3 dní pri teplote 20 °C, kedy dochádza k ste-kuteniu gélu. Nahromaděná biomasa druhovLemonniera sa použije ako zmesné inokulumpody obsahujúcej 20 g kukuřičného výluhu,5 g /3-1,4-manánu (pH 6,0) na 1 liter vodya kultivácia prebieha ďalšie 3 dni pri teplo-te 20 °C. Potom sa biomasa Lemonniera od-filtruje a surový enzým /3-mananáza sa získáodpařením kultivačnej půdy na vákouvej od-parke (celková aktivita /?-mananázy 52 nkat,o specifickéj aktivitě 8,6 nkat/mg proteinu).Příklad 2 . Ako inokulum sa použije kmen Lemonnie-ra aquatica CGMF-124. Na množenie sa po-užije podá obsahujúca 1,6 g gélu sieťované-ho /?-L,4*manánu (A. O. č. 186 059) ponoře-ného do polovice výšky do' Yaest NitrogenBase rastovej pody (0,6 g/100 ml) o pH 5 akultivuje sa po dobu 2 dní pri teplote 15 °C,kedy dochádza k stekuteniu gélu. Nahroma-děná biomasa Lemonniera aquatica sa pou-žije ako inokulum pQdy obsahujúcej kuku-řičný extrakt (20 g) a 5 g galaktomanánuz guaru (Cyamoqsis tetragonoloba L., Fam.Leguminosae) na 1 liter vody (pH 5,5) akultivácie prebieha ďalšie 2 dni pri teplote20 °C. Potom sa biomasa Lemonniera aquas-tica odfiltruje a enzým /3-mananáza sa získáv čiastočne zušfachtenom stave zrážaním sosíranom amonným (stupeň saturácie 0,65).Celková aktivita /3-mananázy 65 nkat o špe-cifickej aktivitě 9,2 nkat/mg proteinu.Příklad 3

Tak ako je uvedené v příklade 1 s tým roz-dielom, že namiesto Lemonniera aquatica sapoužije kmen Lemonniera terrestris CCMF--125. Kultivácia prebieha po dobu 3 dní narastovej pode s kukuřičným výluhom a β--manánom (pH 5,5, teplota 20 °C). Celková

Claims (1)

1. 230888 S aktivita /J-mananázy bola 58 nkat o speci-fické] aktivitě 10,2 nkat na 1 mg proteinu. Vynález má použitie v základnom mikro-biologickom a biochemickom výskume a priprodukcii /2-mananázy ako jedného z důle- žitých enzýmov pri sacharifikácii polysacha-ridov různých dřevných odpadov. Vynálezmožno použit aj pri úpravě vod obsahujú-cich ako odpad extrahovatelnej zložky drev-nej hmoty. PREDMET vynalezu Spůsob produkcie /S-mananázy pomocoumikroskopických húb rodu Lemonniera, vy-značený tým, že kultivujú následovně kmenerodu Lemonniera: Lemonniera aquaticaLemonniera centrosphaeraLemonniera cornutaLemonniera terrestris CCMF — 124CCMF — 149CCMF — 325CCMF — 125 jednotlivo, alebo ich zmesi na živne] podeobsahujúcej /2-1,4-manán alebo syntetickýderivát /3-1,4-manánu pri teplote 15 až 25 °Ca pH 5,0 až 6,0 po dobu 120 až 144 hodin aenzým ,/3-mananáza sa získá v surovom staveodpařením rastove] půdy, připadne v zu-šlachtilom stave zrážaním síranom amon-ným alebo organickými rozpúšťadlami, s vý-hodou etalonem alebo acetónom.