CS230193B1 - Způsob výroby dlouhodobě stabilního suchého a rychle rozpustného oxyhemoglohinu - Google Patents

Description

- Vynález, se týká způsobu výroby suchého, snadno rozpustného oxyhemoglohinu z lidských nebo zvířecích erytrocytů, stabilizovaného proti tvorbě methemoglobinu jak během sušení, tak i při dlouhodobém skladování za teplot kolem 20 °C.

Dosud známé komerčně vyráběné přípravky suchého hemoglobinu (katalogy firem Fluka, Serva, Calbiochem, 1980 až 1983) obsahují 70 až 80 % methemoglobinu, 1 až 5 °/o vlhkosti, je doporučeno je skladovat při °C, jsou pomalu nebo nedokonale rozpustné, což podstatně omezuje jejich širší použitelnost. Nativní oxyhemoglobin s nízkým obsahem nežádoucího methemoglobinu není běžně k dispozici vzhledem ke své značné nestálosti jak v roztoku, tak i v suchém stavu, kdy snadno přechází ze své oxygenačně aktivní formy (s dvojmocným hemovým železem) na neaktivní methemoglobin (se železem trojmocným). Tuto změnu lze, jak známo, značně omezit skladováním zmrazených roztoků hemoglobinu při nízkých teplotách nebo lyofilizací v přítomnosti stabilizátorů, např. sacharózy. U dosavadních lyofilizovaných vzorků však byla řada problémů jak s nestandardností stabilizace a s tvorbou methemoglobinu při dlouhodobém skladování, tak i s pomalou rozpustností lyofilizátu a podobně.

Při podrobnějším sledování podmínek lyofiljzace oxyhemoglohinu a při studiu dosud nejasného mechanismu jeho stabilizace účlnkem sacharózy jsme zjistili některé skutečnosti, kterých lze využít ke zdokonalené výrobě standardního, suchého, dlouhodobě stabilního a rychle rozpustného oxyhemoglObinu vysoké čistoty. Novost vynálezu lze spatřovat v jednoduchém, účinném a technicky výhodném postupu, který se opírá o optimální, tj. nejnižší nutnou koncentraci sacharózy při dané koncentraci hemoglobinu, o vhodný teplotní režim při lyofilizáci a o dokonalé odstranění zbytkové vlhkosti z lyofilizátu. Tím se zvýší rigidnost hemoglobin-sacharózového komplexu a zejména mechanická pevnost sacharózového podpůrného skeletu, který po vysublimování vody fixuje na molekulární úrovni nativní oxyhemoglobinovou strukturu včetně reversibilně navázaného kyslíku. Obsah methemoglobinu v čerstvém lyofilizátu se pohybuje mezi 3 až 7 % (relativně k celkovému hemoglobinu) a během 2 roků skladování při 20 °C nepřesáhne 20 %.

Hemoglobin, hlavní bílkovina uzavřená v červených krvinkách, má stěžejní funkci pro život obratlovců jako přenašeč kyslíku tkáním. Kromě své schopnosti vázat reversibilně molekulární kyslík za tvorby oxyhe' moglobinu má i transportní funkci pro oxid. uhličitý a reaguje ještě s řadou jiných látek. Vazba ligandu obvykle vede k výrazným změnám absorpčního spektra hemoglobinu, což lze využít k různým citlivým a jednoduchým analytickým stanovením příslušných ligandů. Primární struktura hemoglobinu, vyšší prostorové formy jeho molekuly, molekulová hmotnost a další parametry jsou dostatečně známy. Proto je výhodné použít lidských nebo zvířecích hemoglobinů jako barevných standardních látek v hematologii, biochemii, klinické a soudní chemii, při různých typech elektroforézy, izoelektrické fokuzaci, chromatografil, fotometrií a podobně. Nativní oxyhemoglobin má potenciálně široké použití nejen v analytice, ale i v biologických pokusech jako součást médií pro perfúzi a konzervaci izolovaných přežívajících orgánů, pro kultivaci tkáňových kultur, pro výzkum protišokových roztoků přenášejících kyslík, dále v mikrobiologii a podobně. Pokud bude k dispozici sušený, rychle a dobře rozpustný standardní preparát s vysokým obsahem oxyhemoglobinu, otevře se možnost široce jej využít jako běžného reagens bez zvláštních nároků na podmínky skladování po dobu nejméně 1 roku. Lyofilizát podle vynálezu je možno snadno rozpustit ve vodě nebo fyziologických solných roztocích až do koncentrace 200 g/1 oxyhemoglobinu. Pokud by ve speciálních případech byla na závadu přítomnost sacharózy a jiných nízkomolekulárních látek, lze je snadno odstranit např. gelovou filtrací na sloupci Sephadexu G 25 nebo podobného molekulárního síta a současně převést hemoglobin do požadovaného roztoku solí apod. Aby se maximálně vyloučilo případné risiko přenosu infekční hepatitidy u lidského hemoglobinu, vychází se zásadně z nezávadných testovaných lidských erytromas. : Předmět vynálezu je doložen v následujícím příkladu, aniž by však byl tímto , příkladem omezován.

Příklad 1 objemový díl sterilní exspirované lidské erytromasy ne starší než 42 dní po odběru se při 4 °C 4krát promyje centrifugačně přídavkem vždy 2 dílů roztoku chloridu sodného, koncentrace 16 g/1. Po odstranění zbytků plasmy a hlavního podílu leukocytů („buffy coat“) se hemolyzuje 30 minut přidáním 2 dílů hemolyzačního roztoku (0,3 gramu chloridu sodného + 1,35 g glukózy v 1 litru vody] za míchání při 4 °C. Hemolyzát, mající pH 6,3 až 7,0 se centrifuguje 30 až 45 minut při 3000 až 5000 G při 4 °C, k odstranění hlavního podílu stromat. Zbytky stromálních fragmentů se ze supernatantu odstraní postupnou tlakovou filtrací pres azbestocelulózové a nitrocelulózové filtry s konečnou velikostí pórů 0,22 /ím. Ve 100 ml filtrátu obsahujícího 6,3 g hemoglobinu (z toho méně než 0,3 g methemoglobinu a méně než 0,03 g nehemoglobinových bílkovin) se rozpustí 6 g sacharózy a vzorky rozpipetované po 2 ml do lahviček objemu a 10 ml se rychle zmrazí (s výhodou při —35 až —40 °C) a lyofilizují o sobě známým způsobem při sušicích teplotách pod 26 °C (s výhodou 20 až 25 °C), Vysušený oxyhemoglobln obsahující obvykle 0,5 až 2 % vlhkosti se ihned umístí do vakuového exsikátoru s náplní P2O5 a dosouší se 7 až 14 dní do konstantní hmotnosti při teplotě 18 až 25 °C. Exslkátor se zavzdušňuje zvolna přes sušicí baterii lahví s P2O5. Při kontrole přípravku se lyofilizát z 1 lahvičky (obsahující cca 120 mg oxyhemoglobinu, 137 mg sacharózy, 5 až 10 mg methemoglobinu a 5 až 10 mg směsi dalších látek, jako je zejména NaCl, glukóza, nehemoglobinové bílkoviny apod.), rozpustí ve 2 ml vody za pomalého míchání bez třepání během 30 sekund při 10 až 20 °C na jasně červený roztok, který má charakteristické spektrum (i Ostatní parametry) oxyhemoglobinu s příměsí maximálně 8 % methemoglobinu (relativně k obsahu celkového hemoglobinu). lahvičky s oxyhemoglobinem se zátkují gumovými zátkami, pertlují se běžným způsobem a skladují při teplotách 5 až 21 °C.

Claims (1)

1. Způsob přípravy dlouhodobě stabilního suchého a rychle rozpustného oxyhemoglobinu z destromatizovaného hemolyzátu lidské nebo zvířecí sterilní erytromasy lyofilizací v přítomnosti sacharózy a dosušením ve vakuovém exsikátoru, vyznačený tím, že v hemolyzátu s koncentrací oxyhemoglobinu 20 g/1 až 80 g/1, s výhodou 60 g/1, a s relativní příměsí nejvýše 8 % methemoglobinu, se rozpustí sacharóza na konečnou koncentraci 55 g/1 až 80 g/1, s výhodou 60 g/1, pH roztoku se udržuje v rozmezí hodnot 6,2 vynalezu až 7,6, s výhodou 6,7, načež se roztok lyofilizuje za podmínek zmrazení —35 až 40 °C a teploty sušení nepřesahující 26 °C, s výhodou 25 °C, a lyofilizát se ihned dosouší ve vakuovém exsikátoru nad vhodnou sušicí látkou se sušicí účinností podobnou jako P2O5, s výhodou P2O5, při teplotách 15 až 25 °C, s výhodou 20 °C, do konstantní hmotnosti s výhodou po dobu 14 dní, a skladuje se v hermeticky uzavřených nádobkách při teplotách pod 21 °C.