230 070
Vynález sa týká monoklonálnej protilátky proti virusuklieSťovej encefalitidy a spQsobu jej přípravy. Základným predpokladom přesnosti a úspěšnosti imunologic-kých postupov vo virológii je příprava protilátky o žiadanejšpecificite, pre přípravu Specifických protilátok sa využívallen jeden princip - imunizácia zvierat antigénmi /v rQznych mo-difikáciach a kombináciach/, Množstvo, ako i kvalita na takomtoprincipe získaných protilátok velmi závisí od dávky, formy anti-génu a spQsobu jeho podania, rieto ukazovatele sa menia nielenod jedného experimentálneho zvieraťa k druhému, ale i od jednéhoodběru k druhému u toho istého jedinca, uvedené problémy bolipřeklenuté zavedením novej biotechnolQgie přípravy monoklonálnychprotilátok, ktoré na rozdiel od konvenSne připravených protilá-tok majú vyhradenú Specifičnost' a to z toho dQvodu, že sú imuno-chemicky a biologicky homogénnymi produktami cielene dosiahnutejbunkovej linie /&, Kohler, c. Milsteinj Natnre 256, 495, /1975/Pomocou tejto metodiky boli připravené monoklonálne protilátkyproti niektorým obaleným vírusom /&, C, Nowinski, m, R, Stone, M. R, Tam, μ. E, Lostrow, w, N, Burnette, v, P, O*Donnelj Mono-clonal Antibodies, Eds, r, h. Kennet, T, J, Kearn, K. B, Bechtol,plenům Press, n, Y. 295, /I9SO/*, H. Koprowski, T, wiktort Mo-noclonal Antibodies, Eds, R. H, Kennet, T, J, Kearn, κ. B. BecJi-tol, plenům press n, Y, 3I7 /I98O/J w, Gerhard, j, Yewdel, M, S,Frankel, A, D, Lopes, l, staudtt Monoclonal Antibodies/ Eds. R. H, Kennett, τ, ]. Kearn, κ, B, Bechtol, plenům Press n, Y, 335/I98O/J, 23β 070 V případe přípravy Specifických protilátok proti virusukliešťovej encefalitidy vyššie spomenuté nedostatky odstraňujevynález, ktorého podstata spočívá v tom, že sa připravila mono-klonálna protilátka s hemaglutinačno-inhibičnou aktivitou protivirusu kliešťovej encefalitidy vyznačujúca sa tým, že pozostávaz imunochemicky a biologicky identických imunoglobulínových mo-lekúl triedy M z ložených z dvoch Tahkých reťazcov typu k /kappa/a dvoch ťažkých reťazcov izotypuju /mí/, kterých příprava sav našom spdsobe realizuje tak, že slezinové buňky myši imunizo-vanej kmeňom virusu kliešťovej encefalitidy skiica sa spojas 8-azaguanín rezistentnými myšími myelSmovými buňkami a kultí-vujú sa v kompletnom živnom roztoku obohatenom i-glutamínom,2-mierkaptoetanolom, normálnym koňským sérom a antibiotikami,pričom vznikne za selektívneho tlaku aminopterínu nová hybridá-mová buňková línia, ktorá sa klánuje v agare tak, že sa zmieša I % agar s 5,1ο6 slezinovými buňkami a 2 x koncentrovaným médiom,na ktorý sa po zatuhnutí nanesie too hybridných buniek v 0,25 %agare, v ktorom po 10 až 14 dňoch vyrastú kolónie, ktoré popomnožení v kultivačnom médiu nádorovo rastů v 2,6,10,14*tetra-metyIpentadekanom senzibilizovanej peritoneálnej dutině myšíza súčasnej produkcie monoklonálnych protilátok o jednej špeci-ficite proti hemaglutinínu virusu kliešťovej encefalitidyo hemaglutinačno-inhibičnom titre 10256, produkčný hybridám sakultivuje pri 37° c, jeho stredný generačný čas je 20,3 hod, amodálny počet chromozÓmov bol 85. Význam vynálezu spočívá v tom, že sa připravila hybridnábuňková línia produkujúca monoklonálne igM protilátky proti kme-nu skalica /virus kliešťovej encefalitidy/, ktoré reagujú 230 070
Specificky v hemaglutinačno-inhibičnom teste a odstraňujúnevýhody konvenčných antisér. Výhoda predmetu vynálezu spočívá v tom, že produkčná hyb-rídná buňková linia je "nesmrtelná" a produkt tejto hybridnejbunkovej Unie - monoklonálna protilátka je fyzikálne-chemickya biologicky homogénny, Monoklonálna protilátka umožňuje Stan-dardizovat diagnostické testy klieStovej encefalitidy vo vSet-kých íaboratóriach, Monoklonálna protilátka sa mdže využit pridmunoadsorbčnej purífikácii virusu klieSťovej encefalitidy a akoúčinná pomQcka pri analýze štrukturálnych proteínov virusuklieStovej encefalitidy a je vhodná na přípravu monošpecifickýchantisér, Hemaglutinačno-inhibičná aktivita monoklonálnej proti-látky ju předurčuje pre odkrývanie ohnisk klieSťovej encefali-tidy, příklad i Všetky bwMky sa kultivujú v médiu rpmi I64O, ktoré je zlo-žené /mg/ml/ zj dusičnan vápenatý, 4^0 - 100,0, Glukóza - 2000,0,Síran horečnatý,yH^O - 100,0, chlorid draselný - 400,0, strednýfosforečnan sodný,yH^O ·» 1512,0, kyslý fosforečnan sodný ,Η,Ο - o,chlorid sodný - 6000,0, L-arginin - 200,0, L-asparagín - 50,0 ,kyselina L-asparágová - 20,0, L-cystín - 50,0, kyselina L-glu-támová - 20,0, L-glutamín - 500,0, glutation - 1,0, glycin, - 10,0,L-histidín - 15,0, L-izoleucín - 50,0, L-leucín - 50,0, L-lyzín -40,0, L-metionín - 15,0, L-fenylalanín - 15,0, L-prolín -20,0,L-serín - 30,0, L-treonin - 20,0, L-tryptofán - 5,0, L-tyrozín -20,0, L-valín - 20,0, Ό-biotín - 0,2, vitamin - 0,065^ • 5 - 230 070 Ό-pantotenát vápenatý - 0,250, cholinchlorid - 3,0, kyselinalistová - 1,0, i-inozitol - 35,0, nikotinamid -1,0, kyselinap-aminobenzoová - 1,0, pyridoxín-HCl - 1,0, rj^oflavin -0,2,tiamín HCl - 1,0, fenolová červeň - 5,0, kyslý uhličitanu sodný -2000,0 a doplněné s 2 mrnol L-glutamín 5x10“"^ mol 2-merkaptoetano-lu, 100 ug/ml streptomycinu, 100 jednotiek/ml penicilínu, 10 %normálneho koňského séra, 1 mmol Hepes /w-2-hydroxyetylpiperazin-N-2-etan sulfónová kyselina, pre přípravu hybridnej bunkovejlinie sa použije ako nositeT nekonečnej proliferačnej schopnostimyšia 8-azaguanin rezistentná myelómová línia, ktorá sa pomocoupolyetylenglykólu spojí s donorom špecifickej informácie - slezi-novou lymfoidnou buňkou imunizovanéj myši. Myši sa imunizujú ví-rusom kliešťovej encefalitidy /kmeň skalica, ktorý je uloženýv čs, zbierke arbovírusov virologického ústavu SAV v Bratislavěpod číslom iv SAS Cl,gl,53 skalica/ pomnoženom na kuřácíchembryonálnych buňkách, virus sa purifikuje diferenciálnou centri-fugáciou, primárná dávka virusu sa aplikuje myšiam intraperitoneál-ne v množstve 0,2 ml /5I2O HA jednotiek/, sekundárná dávka saaplikuje po 35 dňoch intravenózne v objeme 0,2 ml /320 hemaglu-tinačných jednotiek/, v priebehu 14 dní vyraš tú pod selektívnymtlakom aminopterínu hybridně buňkové linie, ktoré produkujúmonoklonálne protilátky proti hemaglutininu virusu kliešťovejencefalitidy, rieto buňky sa potom klónujú tak, že sa zmieša5-IOXIO6 myších slezinových buniek s médiom a agarom /0,5 %/,po zatuhnutí sa na vrstvu 0,5 % agaru nanesie 100 hybridnýchbuniek v 0,25 % agare, po 10 až 14 dňoch vyrastú kolónie, ktorésa pomnožia v médiu rpmi I64O, Takto pomnožené kolónie představu-jú hybridómovú bunkovú líniu s upevněnou produkčnou schopnosťou 230 070 lonofelondlnyck protilátok, ftalej sa nechajú rásť len tie hybrid-ně buňkové klány, ktoré píliferujú ako in vitro tak aj in vivov peritoneálnej dutině histokompatibilných myší /inbredná líniaBALB/c/, za súčasnej produkcie monoklonálnych protilátok v asci- tických tekutinách až do výšky hemaglutinačno-inhibičného titru* 10256,