CS224618B2 - Způsob syntézy polydesoxynukleotidů - Google Patents
Způsob syntézy polydesoxynukleotidů Download PDFInfo
- Publication number
- CS224618B2 CS224618B2 CS569381A CS569381A CS224618B2 CS 224618 B2 CS224618 B2 CS 224618B2 CS 569381 A CS569381 A CS 569381A CS 569381 A CS569381 A CS 569381A CS 224618 B2 CS224618 B2 CS 224618B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- enzyme
- dna
- reaction
- triphosphate
- reaction mixture
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 37
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 37
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 9
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 5
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 5
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 4
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 2
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 claims 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 10
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 4
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N pyridine-2-thiol Chemical compound SC1=CC=CC=N1 WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 G guenine Chemical compound 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229920006158 high molecular weight polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 150000002730 mercury Chemical class 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000004035 thiopropyl group Chemical group [H]SC([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu přípravy polydesoxynukleotidů z 2 ’-desoxynukleotid-5 '-trifosfátů enzymem DNA-polymerasa, který má více než jednu volnou merkaptoskupinu, nepatřící k aktivnímu centru, v přítomnosti dvojmocnáho kationtu a popřípadě vzorového primárního komplexu ve vodném pufrovaném prostředí o hodnotě pH 6,5 až 9,5, odpovídajícím používanému enzymu, při teplotě 15 až 42 °C.
Vzorovým primárním komplexem je vzorová molekula, která je identická s vyráběnými, žádanými polydesoxynukleotidy.
Je známo, že se enzymatická syntézy polydesoxynukleotidů provádějí způsobem s homogenní fází. Takový způsob je popsán například v těchto publikacích: J. F. Eurd a S. D. Wells,
J. Mol. Blol. 53, str. 435 až 459 (1970); F. J. Bollum, Procedures in Nucleie Aeid Research, str. 591, vydavatel Cantoni, G. L. a Davies, D, R,, New York, Harper 8 Row (1966); J. Sági, A. Szabolcs, A. Szemzo a L. Otvos, Nucleic Acid Research, 4, str. 2 767 až 2 777 (1977).
Při těchto způsobech obsahuje pufrovaná reakční směs substrát, vzorový primární komplex, enzym.a kationty, které zajišťují optimální funkci enzymu. Reakční směs se inkubuje, po ukončení reakce se enzym denaturuje (například zahřátím reakční směsi), pak se vyloučená enzymatická bílkovina ze směsi odstraní. Ze získané polydesoxynukleotidové směsi se polymery s vysokou molekulovou hmotnostní získají čištěním dialýzou.
Takto připravených polydesoxynukleotidů se používá jakožto DNA-modelu pro fyzikální, chemické, biochemické.a biologické studium nukleových kyselin.
Obecně používaným DNA-modelem je například kopolymer 2 '-desoxysdenosin-5 '-monofosfátu (dAMP) a thymin-5'-monofosfátu (dTMP) s přísně se střídající sekvencí a se dvojitou šroubovicí.
...-dAMP-dTMP-dAKF-dTMP-..., který má zkratku: póly d(A-T).
případě od DNA odvozených DNA-polymeras je nukleotidový sled nového DNA-vlákna určován nukleotidovým sledem vzorové DNA, vnesené do směsi. Pro syntézu póly d(A-T) je tedy zapotřebí takového póly d(A-T) vzorového primárního komplexu, '/nesením odpovídajícího vzorového primárního komplexu je možno vyrábět různé polydesoxynukleotidy, jako například poly/dA/.poly/dT/, póly d/G-C/, póly d/I-C/, poly/dG/.poly/dC/, poly/dl/.poly/C/, přičemž A znamená adenin, T thymin, G guenin, I inosin a C cytosin.
Jednotlivé DNA-poly,meresové enzymy jsou naproti tomu schopny také bez z venku vneseného vzorového primárního komplexu tak zvané denovo syntézy poldy d/A-T/. Takovým enzymem je například enzym S.coli DNA-polymerasa I.
Nedostatkem známých způsobů pro enzymatickou přípravu polydesoxynukleotidů je skutečnost, že se enzymu může použít toliko jednou a že při zpracování reakční směsi je odstraňování enzymu spojeno s jeho denaturalizací.
Je proto třeba vypracovat takový způsob přípravy, který by neměl tento nedostatek.
Základem vynálezu je poznatek, že shora uvedený cíl je dosažitelný) jestliže se syntéza polydesoxynukleotidů provádí za pomoci enzymu vázaného na pevný nosič. Tak se může ,enzym odstranit z reakční směsi jednoduchým odfiltrováním a může se ho opětovně používat.
Dalěím základem vynálezu je poznatek, že se na pevný nosič mohou vázat a tak pro tento účel používat takové DNA-polymerasové enzymy, které mají více než jednu merkaptoskupinu, která netvoří část aktivního centra enzymu. Těmito skupinami se totiž může enzym substitucí protonu vázat na vhodný nosič, aniž tato vazba způsobuje ztrátu aktivity nebo pokles aktivity.
Na základě shora uvedeného se tedy vynález týká způsobu příprav polydesoxynukleotidů z 2 ”-desoxynukleosid-5 '-trifosfátů s DNA-polymerasovým enzymem, který má více než jednu merkaptoskupinu, které nepatří k aktivnímu centru, v přítomnosti dvojmocného kationu a popřípadě vzorového primárního komplexu ve vodném pufrovém prostředí o hodnotě pH 6,5 až 9,5, odpovídajícím použitému enzymu, při teplotě 15 až 42 °C. Podle vynálezu se postupuje tak, že se jakožto DNA-polymerasového enzymu používá enzymu s merkeptoskupinami schopnými vazby na pevný nosič kovalentní vazbou.
Při provedení způsobu podle vynálezu se jakožto pevného nosiče používá imobilizovaného činidla, které má thiolové skupiny.
K vázání enzymu jsou vhodné takové pevné nosiče, které jsou schopny vázat merkaptoskupinu. K takovým nosičům patří zmobilizovaná thiolová činidla s modifikovanou agarosovou bází, jako jsou například Thiopropyl-Sepharosa 6B (Pharmacia Information Booklet, ,977) nebo aktivovaná Thiol-Sepharosa 4B (Pharmacia Information Booklet, 1974).
Struktura Thiopropy.l-Sepharosy 6B je
přičemž matricí je modifikovaná agarosa.Thiopropyl-Sepharosa 6B obsahuje 20 /umol 2-thiopyridylových skupin na 1 ml zbotnalého gelu; 1 g lyofylizováného gelu zaujímá ve zbotnalém stavu objem přibližně 3 ml. 2-Thiopyridylovou skupinou maskovaná a aktivovaná imobilizovaná thiolová skupina se může -uvolnit různým způsobem, může se však také uvádět do reakce přímo s merkaptoskupinou za vytvoření disulfidové vazby. Podle informačního materiálu Pharmacia je molární extinkční koeficient přitom odštěpeného 2-thiopyridonu při 343 nm 8,08 x x 16¾-1 cm-'.
Zvolený pevný nosič se zbotná v kaliumfosfátovém pufru /hodnota pH 7,4/, pek se plní do kolony a pek se vnese v pufru rozpuštěný emzym.
Podle vynálezu se používá takových enzymů, které obsahují volné merkaptoskupiny schopné reakce. K nim patří z bakterie Escherichia coli izolovaný enzym DNA-polymerasa typ I (Kornbergova polymerasa). Je to kulovitá molekula bez podjednotky o molekulové hmotnosti 109 000 g/mol obsahující 975 aminokyselin. Její aktivní centrum obsahuje též lysinovou e arigininovou molekulu. V molekule je jedna jediná sulfidová vazba a jedna sulfhydrylová skupina. Sulfhydrylová skupina se může bez snížení aktivity uvádět do reakce s jodscetátem a se solemi rtuti.
Podobně jako enzym z E.coli se inhibují také z jiných bakterií (Bacillus subtilis, Micrococcus lisodeicticus a íúycobacterium tuberculosis) izolované DNA-polymerované enzymy typu I nikoliv sulfhydrylovými činidly, tedy podobně jako se Imobilizuje enzym z E.coli. Současně se však ze čtyř druhů bakterií isolované DNA-polymerasové enzymy typu II a III inhibují sulfhydrylovými činidly, takže se nemohou vázat shora uvedeným způsobem na pevný nosič. Z organismů savců dosud izolovaných DNA-polymeras (EC.2;7.7.7.) se rovněž alfa-polymerasy a gama-polymerasy inhibují, zatímco bete-polymerasa se sulfhydrylovými činidly neinhibuje.
Na kolonu vnesený, v pufru rozpuštěný enzym se dalším enzymem spláchne do kolony a pak se směs pro co možná dokonalou vazbu desetkrát přečerpá peristaltickým čerpadlem. Reakce pro bíhá podle reakčního schématu.
R-S-S ~<O> + H-SH-> R-S-S-E + S =/C?S kde znamená
E enzym DNA-polymerasu typu I a
R Sepharosa-O-CH2-CH-CH2-.
OH
Množství vázaného enzymu se může přímo stanovit měřením molární absorpce světla odštěpené 2-thiopyridonové skupiny, nepřímo měřením množství DNA, která se vyrobí syntézou kstalyzovanou enzymem.
Po ukončení reakce vázání enzymu se pufr vypustí, gel se promývá dalším čerstvým pufrem zprvu tak dlouho, až spektrum odtékajícího pufru není stejné jako čistého pufru, což je asi 10 ml. Pak se promývá dalšími 40 ml rychlostí 1 ml/min. Pro spektrofotometru se používá registračního spektrofotometru.
Takto vázaného enzymu se pak používá pro syntézu polydesoxynukleotidů. Pro syntézu použitá reakční směs obsahuje ve vodném prostředí jakožto substrát použité desoxynukleotidy a vzorový primární komplex.
Reakční směs se nastaví pufrem, jehož množství a kvalita musejí zajistit optimální funkci použitého enzymu, na hodnotu pH 6,5 až 9,5. Do reakční směsi se kromě toho přidává kovová sůl zajištující optimální funkci enzymu, nejlépe hořečnatá sůl, v odpovídající koncentraci.
Kolona se temperuje na 37 °C a nanese se na ni reakční směs o teplotě rovněž 37 °C; pak se přečerpává odpovídajícím peristaltickým čerpadlem.
Postup reakce se může sledovat různými způsoby, například měřením radioaktivity látky nerozpustné v kyselině, papírovou chromatografii, analýzou koneěného produktu nebo kontrolní reakcí.
V případě měření radioaktivity musí reakční směs obsahovat také značený substrát,
K tomuto účelu se může použít například dATP. Měření se provádí tak, že se z kolony vytékající směsi odebírá v určitých časových obdobích vzorek vždy o objemu 25 pl Hsmiltonovou mlkropipetou a alikvoty se měří na skleněných filtračních destičkách typu GF/G (průměr .2,5 cm, Whatmen). Vkládají se do roztoku (10 ml roztoku na skleněný filtr, 0 až 5 °C 10 minut) ze studené 5% trichloroctové kyseliny o teplotě 0 až 5 °C (TGA) a 1% natriumpyrofosfátu, promyjí se dvakrát 5% roztokem trichloroctové kyseliny ε pak dvakrát 96% ethylalkoholem a nakonec dvakrát diethyletherem a suší se na vzduchu. Radioaktivita v kyselině nerozpustných polymerních molekul (polymeru sestávajícího z více než 10 monomerních molekul) se měří ve směsi s toluenem Packardovým spektrometrem. Tímto způsobem se může sledovat teké kontrolní reakce.
Papírová chromatografie je vhodná v přípedě radioaktivních substrátů ke kvantitativnímu a u neaktivních substrátů naopak ke kvalitativnímu sledování reakce. Na 1 cm široký a 15 až 18 cm dlouhý papírový proužek DE 81 (DEAE-celulóze, whetman) se nanese 5 až 25 /ul reakční směsi. Jakožto prostředku se používá 0,15 M roztoku hydrogenuhličitanu amonného:
R^. hodnoty nukleotidů jsou 0,35 až 0,55, polynukleotidy zůstávají ns výchozím bodu.
Do z gelu vypuětěné a vymyté (při 260 nm kontrolované) reakční směsi se přidává roztok obsahující 2,5 molu chloridu sodného a 0,038 molu ethylendiamintetraoctové kyseliny na litr roztoku v objemovém poměru 1 : 0,65 a pak se směs udržuje po dobu 10 minut na teplotě 70 °C. Po ochlazení se vytřepe třikrát stejnými objemy směsi chloroformu a isoamylalkoholu v poměru 24 : '. Dvě fáze se oddělí (odstředěním nebo na pepíru k dělení fází, Ahatman) a vodná fáze se dialýzuje dvakrát destilovanou vodou za (míchání, teplote 4 °C, kontinuálně). Měří se vodivost dialyzovaného roztoku. Když vodivost po průtoku 0,8 1 dvakrát'destilované vody dosáhne hodnoty dvakrát destilované vody (0,2 až 0,6 juS) dialýzuje se dalšími 0,4 až 0,5 litry dvakrát destilované vody. Pak se produkt lyofilizuje až k suchu a vyjme se do 1C~2 molu TRIS.HC1 (o hodnotě pH 7,4), a Ifc-^ molu ethylendiairintetrooctové kyseliny; roztok má objem 500/ul. Ze získaného roztoku odebrané alikvoty se podrobují stanoveni koncentrace, ultrafialového spektra, tepelné hyperchromicity ε aktivity vzoru. Polymerní roztok se skladuje při teplotě -25 °C.
Kontrolní reakce: Do 165/ul reakční směsi (stejného složení, jako má směs použitá při reakci s zmobilizovaným enzymem) se přidá množství enzymu objemově odpovídající ε inkubuje se při teplotě 37 °C. Vzorek se odebírá ve stejných časových obdobích jako v případě kontrolované reakce a shora popsaným způsobem se nanáší na skleněný filtr (GF)C, zpracovává se a provede se měření.
*
Skladování a opětné použití imobilizovaného enzymu se provádějí tímto způsobem:
Po'vypuStění a vymytí reakční směsi se gel promyje dalšími ICO ml 60 mM knliuxfosfátového pufru a pak 20 ml 0,02% roztoku natriumazidu a v něm se ve sloupci nebo po odstranění z něho skladuje při teplotě 3 až 6 °C. Po vymytí natriumazidového roztoku se enzymu může znovu použít; při opětovném použití jeho původní aktivita klesá sotva o 0 až j í. Nejvíce znovu zkoumaným a stabilizovaným zmobilizovaným enzymem byla E.coli DNA-polymerssa I, stupen II: v průběhu dvou měsíců se její aktivita při šestkrát opakovaném použití nezměnila.
Způsob podle vynálezu má tyto důležité přednosti:
a) Na pevný nosič kovalentní vazbou vázaný enzym DM-polymernsa se podílí no syntéze desoxypolynukleotidu reakcí s hetsrogenrí fází, po ukončení reakce se může bez denaturalizrc z reakční směsi odstranit.
b) Vázaného enzymu se může opakované používat.
e) Vázaného enzymu se také může používat při kontinuálním provozu. Způsob podle vynálezu lezu blíže objasňují příklady provedení.
Příklad 1
a) Způsob přípravy Thiopropyl-Sepharosy 6B g lyofilizovaného obchodního thiolového činidla Thiopropyl-Sepharosa 6B se nechává zbotnat po dobu 15 minut při teplotě místnosti v 60 mK kaliumfosfátového pufru (hodnota pH 7,4), pak se plní do skleněné kolony s pláštěm a se skleněným filtrem (’,5 x '5 cm) a promyje se 200 ml hora uvedeného pufru, aby se obchodní přidaný stabilizářní prostředek vymyl.
b) do přibližně 0,5 ml pufru nad usazeným, bublin prostým gelem se přidá ICO jednotek (20 jíl) E.coli MKE 600 DNA-polymerasy I, stupen I s měrnou aktivitou 3 85C jednotek/mg bílkoviny Hamiltonovou mikropipetou. (Jedna jednotka enzymu DNA-polymerasa vestaví !0 nmolu celkového nukleotidu při teplotě 37 °C v průběhu 30 minut do v kyselině nerozpustného polymeru v přítomnosti odpovídajícího vzorového primárního komplexu v určitém pufru). Pomalým odkapáváním se vpustí do gelové vrstvy (0,1 až 0,2 ml/min) a spláchne se do ní dalšími 10 ml pufru při teplotě místnosti a pak se přečerpá desetkrát peristaltickým čerpadlem.
c) Syntéza póly d(A-T)
Sloupce se temperují termostatem na 37 °C a pak se do gelu vpustí 10 ml reakční směsi tohoto složení: 60 mmol/1 kallumfosfátu hodnota pH 7,4), ó mraol/1 chloridu hořečnstého, mmol/1 [jPj dATP jehož měrná aktivita je 10,9 rozpadů/min na mol , 1 mmol/1 dTTP,
100 umolu [p] /1 aktivovaného póly d/A-T/ vzorového primárního komplexu rozpuštěného dvakrát destilovanou vodou na objem 10 ml. Mrtvému prostoru odpovídajících 2 až 3 ml pufru (kontrolováno spektrofotometricky) se vylije, pak se reakční směs peristaltickým čerpadlem přečerpává rychlostí 0,5 ml/min. Postup reakce se může sledovat měřením radioaktivity.
r
Po reakční době 24 hodin je vzniklé množství polymeru na základě vestavění i_H J dAMP do v kyselině nerozpustné látky 3,04 mg. Spotřebuje se 45 % substrátu.
Z takto získaného póly d/A-T/ se oddělí dialýzou látky s nízkou molekulovou hmotností. Množství čistého a nativního póly d/A-T/ s vysokou molekulovou hmotností 200 COO g/mol je 2,2 mg.
Přiklad 2
Způsobem popsaným v příkladu 1 se váže 150 jednotek (100 /ul) enzymu E.coli MRE DtíA-polymeraee I, stupeň II s měrnou aktivitou 116 jednotek/mg bílkoviny na imobilizované thiolové činidlo. Syntéza se provádí způsobem popsaným v příkladu !. Jakožto substrátu se používá mmol/1 iP dATP a 2 mmol/1 dTTP. Množství takto v průběhu 4 hodin syntetizovaného polymeru je podle měření radioaktivity 2,37 mg, spotřeba substrátu je 18 %. Molekulová hmotnost izolovaného a čištěného polymeru je nízká (5 až 200 000 g/mol), jeho množství je 1,78 mg.
Příklad 3
Ne imobilizované thiolové činidlo se váže způsobem popsaným v příkladu 1 45 jednotek (50 /*1) enzymu B. coli MRE 600 DNA-pclymerass I ve formě fragmentu (enzym A podle Klenowa) s měrnou účinností 6 940 jednotek na mg bílkoviny. Také syntéza se provádí způsobem popsaným v příkladu 1. Jakožto .«substrátu se používá 0,5 mmol/1 ['tPj dATP a 0,5 mmol/1 dTTP. Podle měření radioaktivity je množství takto v průběhu 24 hodin syntetizovaného veškerého polymeru 22,74 mg,
224613 spotřeba substrátu je 82 %. Izolovaný, čištěný póly d/A-T/ má vysokou molekulovou hmotnost (větší než 2t0 OCC g/mol) a jeho množství je 2,12 mg.
Claims (1)
- Způsob syntézy polydesoxynukleotidů z 2'-desoxynukleotid-5'-trifosfátů, jako je 2'-desoxyadenosin-5'-trifosfát a thymidin-5'-trifosfát nebo 2-desoxyguanosin-5'-trifosfát a 2'-desoxycytidin-5'-trifosfát, DNA-polymeresovým enzymem, který má alespoň jednu merkaptoskupinu, která nepatří k aktivnímu centru, v přítomnosti dvojmocného kationtu a popřípadě vzorovému primárnímu komplexu v pufrovaném vodném prostředí o hodnotě pH 6,5 až 9,5, odpovídajícím použitému enzymu, při teplotě I5 až 42 °C, vyznačující se tím, že se jako DNA-polymerosavého enzymu používá enzymu vázaného kovalentní vazbou na pevný nosič schopný vázat merkaptoskupiny, kterým je imobilizované činidlo obsahující thiolovou skupinu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS569381A CS224618B2 (cs) | 1981-07-27 | 1981-07-27 | Způsob syntézy polydesoxynukleotidů |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS569381A CS224618B2 (cs) | 1981-07-27 | 1981-07-27 | Způsob syntézy polydesoxynukleotidů |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS224618B2 true CS224618B2 (cs) | 1984-01-16 |
Family
ID=5402270
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS569381A CS224618B2 (cs) | 1981-07-27 | 1981-07-27 | Způsob syntézy polydesoxynukleotidů |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS224618B2 (cs) |
-
1981
- 1981-07-27 CS CS569381A patent/CS224618B2/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5817786A (en) | Single-stranded labelled oligonucleotides of preselected sequences | |
| EP0379559B1 (en) | Method and reagents for detecting nucleic acid sequences | |
| US5476930A (en) | Non-enzymatic ligation of oligonucleotides | |
| Lillehaug et al. | Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase | |
| JP2000513587A (ja) | 不連続プライマー伸長による核酸の反復配列長の決定 | |
| CA2297776A1 (en) | Base analogues | |
| JP2562862B2 (ja) | 鋳型依存性酵素的核酸合成用プライマーとしてのオリゴヌクレオチド同時合成および直接標識化のための機能性担体 | |
| EP0785941B1 (en) | Porphyrin labeling of polynucleotides | |
| Hinton et al. | T4 RNA Ligase joins 2'-deoxyribonucleoside 3', 5'-bisphosphates to oligodeoxyribonucleotides | |
| AU603500B2 (en) | Carrier for the enzymatic or chemical and enzymatic reaction of nucleic acids or nucleic acid fragments on solid phases | |
| EP0542292B1 (en) | Method for producing 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate | |
| CS224618B2 (cs) | Způsob syntézy polydesoxynukleotidů | |
| AU1378300A (en) | Method and test kit for analyzing DNA repair | |
| Miwa et al. | Reconstituted F1-ATPase complexes containing one impaired β subunit are ATPase-active | |
| Nadeau et al. | Use of ribonucleosides as protecting groups in synthesis of polynucleotides with phosphorylated terminals | |
| Pollack et al. | Snake venom phosphodiesterase: A zinc metalloenzyme | |
| JPS6125499A (ja) | 放射性標識に結合させた核酸プロ−ブ | |
| Lillehaug et al. | Phosphorylation of tRNA by T4 polynudeotide kinase | |
| US5958696A (en) | Quantitative solid phase helicase assay | |
| GB2102005A (en) | Process for synthesis of polydeoxynucleotides | |
| EP0206411A2 (en) | Reverse phase chromatography in oligonucleotide sequencing | |
| DE3131052C1 (de) | Verfahren zur synthetischen Herstellung von Polydesoxynucleotiden | |
| Chu et al. | Postsynthesis functionalization of oligonucleotides | |
| CH647808A5 (en) | Process for the synthesis of polydeoxynucleotides | |
| JPS6336756B2 (cs) |