CS223474B1 - Způsob imobilisace celých buněk, případně subcelulárních částic - Google Patents

Abstract

Vynález se týká imobilisace buněk, případně subcelulárních částic, který spočívá v tom, že imobilisace se provede prostřednictvím aktivovaných sacharidových složek obsažených v příslušných stěnách či membránách. Aktivace se provede oxidací sacharidové komponenty buněčné stěny působením jodistanových iontů v množství 0,025 až 0,5 mmolů na 1 g vlhkých buněk při [H 4 až 8 a teplot® 0 až 30 °C po dobu 1 až 24 hod. a následující vazbou vzniklých aldehydových skupin s aminoskupinami nosiče se provede imobilisace. Imobilisace buněk s oxydovanou cukernou složkou se též dosáhne prokřížením buněk pomocí vícefunkčních aminů, resp. peptidň či bílkovin. Imobilisované buňky jsou využívány pro vysoce specifické reakce realisovatelné v řadě průmyslových odvětví například v potravinářském průmyslu nabo v organické chemii se uplatňují při mikrobiálních transformacích.

Description

Vynález se týká způsobu imobilisace celých buněk, případné subcelulárních částic.

Dosavadní převážné používané postupy imobilisací buněk spočívají v zabudování do příslušné matrice gelu. Jako gelů bylo použito řady materiálů at již syntetického či přírodního původu, například polyakrylamidového gelu, triacetátu ceíuloay, kolagenu, agaru, alginanu vápenatého, kapa-carrageenanu á želatiny překřížené glutaraldehydem. Další velmi častý způsob imobilisace buněk spočívá v jejich prokřížení bifunkčními činidly, nejčastěji pomocí glutaraldehydu. U buněk byla rovněž popsána imobilisace prostřednictvím jejich navázání buá iontovou, nebo kovalentní vazbou. Byla popsána též vazba buněk na uměle vytvořené polymerní komplexní hydroxidy různých kovů, zejména zirkonia a titanu.

Při imobilisací buněk je využíváno biochemických systémů buňky pro vysoce specifické reakce realisovatelné v řadě průmyslových odvětví. Hlavními výhodami použití těchto biokatalysatorů je kromě uvedené specifity možnost pracovat za fyziologických podmínek, to je normální teplotě a tlaku, hodnot pH a podobně, čímž mnohdy dochází k výraznému snížení energetické náročnosti provedení katalysované reakce či sledu reakcí. Použitím imobilisovaných buněk je navíc často odstraněna isolace produktu z reakční směsi, přičemž použitý biokatalysator může být opakovaně použit.

Na rozdíl od imobilisace enzymů odpadá při imobilisací buněk nutnost většinou velmi náročné isolace jednotlivých volných enzymů, při níž dochází ke ztrátě aktivity enzymu a snížení jeho stability. U imobilisovaných buněk zůstává v podstatě

- 2 223 474 zachováno fysiologické prostředí a tím si enzymy uchovávají aktivitu po delší dobu.

Způsob imobilisace buněk, případně subcelulárních částic, podle vynálezu spočívá v tom, že buňky, případně subcelulární částice a aktivovanými sacharidovými složkami se imobilisují prokřížením pomocí bifunkčních, více funkčních aminů, peptidů či bílkovin nebo vazbou na nosiče obsahující primární nebo sekundární aminoskupinu. Aktivace sacharidové složky se provádí oxidací polyeacharidů obsažených v buněčné stěně působením jodistanových iontů v množství 0,025 až 0,5 mmolů na 1 g vlhkých buněk při pH 4 až 8 a teplotě 0 až 30 °C po dobu 1 až 24 hod. a vzniklé volné aldehydové skupiny reagují s primární nebo sekundární aminoskupinou nosiče nebo prostřednictvím Ugiho čtyřkomponentní kondensace reagují s primární aminoskupinou nosiče·

Způsob podle vynálezu se rovněž vyznačuje tím, že imobilisace oxidovaných buněk je prováděna prokřížením pomoci bifunkčních, respektive vícefunkčních aminů, peptidů či bílkovin.

V kombinaci s Ugiho reakcí je prokřížení uskutečněno i pomocí di- i vícefunkčních karboxylových kyselin či příslušných isonitrilů.

Výhoda způsobu imobilisace buněk dle vynálezu spočívá v šetrnosti a experimentální jednoduchosti použité metody. Způsobem podle vynálezu je získán preparát s vyšší enzymovou aktivitou ve srovnání nejen s preparáty získanými dříve používanými způsoby imobilisace, ale i s původními nativními buňkami .

Vynález je dokumentován příklady použití.

Přiklad 1

Buňky Saccharomyces cerevisiae kultivované v kompletním mediu se sacharosou a glukosou byly po odstředění proiqyty Oj05 lú fosfátovým, respektive acetátovým pufrem pH 6,5. K odstředěným buňkám o invertasové aktivitě 29 nkat/g vlhkých buněk /stanoveno Somogyiho metodou/ byl přidán 0,05 X acetátovy

223 474 pufr ρίί 6,5 v poměru 12,5 ml na 1 g vlhkých odstředěných buněk /v/w/ a 0,05 M jodistan sodný /1:1, v/to/. Směs byla třepána 6 h při 4 °C za nepřístupu světla. Oxidované buňky byly odstředěny a prosy ty 0,05 M fosfátovým pufrem pK 7,3. K odstředěným oxidovaným buňkám oyl přidán 0,05 M fosfátový pufr pH 7,3 /12,5:1, v/w/ a epichlorhydridem a 1,6-diaminohexahem aktivované perlové celulosa v poměru lg vlhké odsáté celulosy na 1 g vlhkých oxidovaných buněk. Reakční směs byla třepána 16 h při 4 °G a poté dekantována 0,05 U fosfátovým pufrem pH 6,5·

U isolovaného preparátu imobilisovaných buněk Saccharomycas cerevieiae byla zjištěna invertasová aktivita 56 nxat/g vlhxého odsátého konjugátu.

Příxlad 2 n odstředěným a promytým buňkám Saccharomyces cerevisiae byl přidán 0,05 ϋ fosfátový pufr pH 6,5 v poměru 10 ml pufru na 1 g vlhkých buněk /v/w/ a 0,05 M jodistan sodný /1:1, v/to/. Po 6 h třepání při 4 °C za nepřístupu světla bylo pH směsi upraveno na hodnotu 7,5 přídavkem 1 M Na^HK^ a poté byla při- l dána epichlorhydridem a 1,6-diaminohexanem aktivovaná perlová celulosa v poměru 1 g vlhké odsáté celulosy na 1 g odstředěných buněk. Následující postup byl shodný jako v příkladu 1, získaný preparát imobilisovaných buněk vykazoval invertasovou aktivitu 31 nkat/g vlhkého preparátu.

PřÍKlad 3

Oxidované buňky Saccharomyces cerevisiae připravené postupem popsaným v příkladu 1 byly smíchány s l%nía roztokem albuminu v 0,1 M fosfátovém pufru pH 7,5 v poměru 1:24 /w/v/. Suspense byla třepána 1 h*při 4 °C, po přidání 5%níno vodného j roztoku glutaraldehydu /1:4, w/v/ byla reakční směs opět třepána 1 h při 4 °C. U získaného preparátu imobilisovaných buněx; byla stanovena invertasová aktivita 87 nkat/g vlhkého odsátého preparátu.

Příklad 4

K desintegrovaným a 0,05 M acetátovým pufrem pří 5 promytým buňkám xvasinek Saccharomyces cerevisiae o invertasové aktivitě 2 nkat/g byl přidán 0,05 M acetátový pufr pH. 5

- 4 223 474 /1:500, w/v/ a 0,05 il jodistan sodný /1:40, w/v/. Směs byla třepána 3 h při 20 °0 za nepřístupu světla. Po promytí 0,05 fosfátovým pufrem pH 6,5 byl k oxidovaným desintegrovaným buňkám kvasinek Saceharomyces cerevisiae o invertasové aktivitě 10 ukat/g přidán 0,05 M fosfátový pufr pH 6,5 /1:500, w/v/, 1,6-diaminohexanem modifikovaný glycidylmethakrylétový gel 0-70¹⁹ /6 g na 1 g výchozích dezintegrovaných buněk/, cyklohexylisokyanid /1:500, v/w/ a 0,5 M kyselina octová Λ:25Ο, v/w/. Směs byla míchána 6 h zpočátku při 4 °0 a postupně při vzrůstající teplotě až při 20 °C. Pq důkladném promytí 0,05 U fosfátovým pufrem píí 5 a 1 M chloridem sodným v tomto pufru byla u získaného preparátu zjištěna invertasové aktivita 0,82 ukat/g vlhkého preparátu.

Claims (2)

1. Způsob imobilisace celých buněk, případně subcelulérních částic, vyznačený tím, že se sacharidové složky buněk, případně subcelulérních částic aktivují působením jodistanových iontů, načež se imobilisují prokrížením pomocí bifunkč nich, vícefunkčních aminů, peptidů či bílkovin nebo vazbou na nosič obsahující primární nebo sexondární aminoskupinu.

2. Způsob podle oodu 1, vyznačený tím, že aktivace sacharidové složky buněk, případně subcelulárních částic se provádí jodistanovýai ionty v množství 0,025 až 0,5 mmolú na 1 g vlhkých buněk při pH 4 až & a teplotě 0 až 30 °c po dobu

1 až 24 hod.