CS221747B1 - Spósob přípravy imunosorbentov z polysacharidov izolovaných z kvasiníek - Google Patents

Abstract

Vynález sa týká odboru^chémie, bioché- mie, .imunologie a mikrobiologie. > Účelom vynálezu je příprava nerozpuštěného imunosorbenta z polysacharidov izolovaných z kvasiniek, ktorý má tt^ vlastnost, že je schopný sorpčne viazať na svojom povrchu bielkovinové protilátky proti róznym hubovitým ochoreniam. Uvedeného účelu sa dosiahne tak, že polysacharid izolovaný z kvasinkovitých buniek sa sieťuje v alkalickom prostředí bifunkčným reagentom najvýhodnejšie s epi- chlórhydrinom v množstve 15 až 30 % hmot. na hmotnosť suchého polysaoharidu při teplotách do 50 °C. Po zosietení sa nerozpustný polysacharidový gél suspenduje na rýchloobrátkovom mixéri vo vodě na částice o velkosti 80 až 250 mikrónov, ktoré sa potom odfiltrujú, dobře premyjú vodou a . voda sa vytěsní organickým ro;púšťadlom s výhodou etanolom alebo acetonom. Zosiatený vysuSený polysacharidový imunosorbent má napúčaoí objem vo vodě 4 až 8 ml/g a je vhodným nosičom pre izo*·' láciu a purifikáciu protilátok účinných proti róznym hubovitým ochoreniam. Vynález má využitie v humánněj i ve- terinárnej medicíně pri izolácii protilátok proti róznym hubovitým ochoreniam.

Description

221747 2

Vynález sa týká spísobu přípravy imunosorbentov z polysacharldov izolovaných z kvasi- niek.

Hlavnou imunologicky aktívnou zložkou kvasiniek a kvaainkovitých mikroorganizmov súBanány, alebo manozu obsahujúce heteropolysacharidy ako galaktomanány, glukomanány, gluko-rónoxylOmanány, ktorá sa nachádzajú na povrchu buniek týchto mikroorganizmov. Manány pato-génnych druhov rodu Candida sú vysokovetvené póly sacharidy, ktorá majii v hlavnom reťazi“(1-6), v božných reťazoch a (1-2), připadne a (1-3) glykozidická vazby. Imunodominantnouskupinou týchto antigánov sú božná reťazce skladajúce sa z 9-6 manéžových jednotiek vlaže-ných (1-2) glykozidickými vazbami (S. Suzuki a H. Sunayama: Jap. J. Uicrobiol. 13, 95/1969/).

Imunologicky aktivně polysacharidy mikroorganizmov sa izolujú zo živného média nie-kolkonásobným zrážaním etanolom, z biomasy kvasiniek extrakciou s hydroxidem draselnýmo koncentrácii 2 % hmot. (P. A. J. Gorin a J. F. T. Spencer: Adv. Appl. Uicrobiol., 13, 25/1970/) alebo s 0,2 U chloridem sodným (0. Šikl a spol.: Coll. Czechoslov. Chem. Commun, 35, 2 969 /1970/) pri zvySenej teplote. čisté manány sa získavajú následným niekoTkonásob-ným zrážaním rozpustných polysacharldov Fehlingovým roztokom. Výtažky imunologicky aktív-nych manánov sú vSak velmi nízké a vzhladom na pdvodnú biomasu nepřesáhujú 5 % hmot.

Uanány patogénnych kvasinkovítých mikroorganizmov sú vo vodě dobré rozpustné a nedajúsa priamo použit na přípravu pevných sorbentov. Aby se získali vhodné nerozpustné sorbenty . je potřebné polysacharidy z kvasinkovitých mikroorganizmov vhodné modifikovat sletováním <t. Kuniak, Η. H. Uarchesault: Starch 24, 110 /1972/), a to tak, aby imunodominantné sku- piny polysacharidu boli zachované pre imunosorpciu Specifických protilátek z krvného séra.

Molekulová hmotnost manánov polysacharldov kvasinkovitých mikroorganizmov je relativné nízká a pohybuje sa medzi 15 000 až 30 000. Na jednej molekule polysacharidu sa nachádza niekol'ko determinantných skupin, avšak len žesť z nich sa zúžastňuje špecifickej imunolo- gickej reakcle antigén - protilátka. (J. Šandula a U. Vojtková: Folia Microbioiogica, 19, 94 /1974/). Zosieťovaním manámu dochádza eSte k hustejšiemu rozloženiu determinantných skupin v makromolekule manánu, takže žast aktívnych centier imunosorbenta sa nezúžastňuje interakcie antigén - protilátka z priestorových ddvodov.

Imunologicky aktivně manány sa vyskytujú v buňkových stěnách kvasiniek v komplexes bielkovinami a imunologicky neaktívnym glukanom (C. E. Ballau: Adv. Uicrobiol. Phys. 14,93 /1976/). Úplné odstránenie týchto sprievodných biopolymérov naráža na tažkosti a vyža-duje zložitý purifikažný proces. Zistili sme, že pře přípravu úžinného imunosorbentu nieje potřebné manán úplné purifikovat, malé množstvo bielkoviny a glukénu nie je na závadu.Purifikažnými stupňami jednak klesá výtažok polysacharidu, klesá jeho molekulová hmotnostžo stažuje úžinné zosieťovanie polysacharidu a nie zanedbatelnou mierou klesá počet imuno-dominantných skupin schopných viazat homológne protilátky, preto je výhodnejšie použitpolysacharid len žiastožne purifikovaný s vyššou molekulovou hmotnósťou.

Podstata vynálezu spožlva v tom, že polysacharid izolovaný z kvasinkovitých mikroorga-nizmov s výhodou Candida albicans alebo Candida tropicalis sa v prvom stupni zosieťujebifunkžným sietovaclm reagentom s výhodou 1-chlór-2,3-epoxypropanom v množstve ,5 až 30 %hmot. na hmotnost polysacharidu v alkalickom prostředí a v druhom stupni sa zosieťovanýpolysacharidový gél podrobí vodnej dispergácii vo vysokoobrátkovom mixéri za sážasnej neu-tralizácie volných alkálil a v treťom stupni sa premyté nerozpustné polysacharidové částiceodvodnia na filtri alkoholem a vysušia pri teplote do 60 °C.

Takto připravený nerozpustný polysacharid s veTkosťou častíc 60 až 250 /um je vhodnýmimunosorbentom pre izoláciu protilátok proti rdznym hubovitým ochoreniam.

Najžastejším pdvodcom mykotických ochorení u Pudl je Candida albicans, na ktoré připa-dá výše 80 % patologických mikrobiologických nálezov. Zbytok tvoria mikroorganizmy ako 3 221747

Candida tropicalis, C. stellatiodea, C. guilliermondi, C. parapsilosis, C. famata a iné.Mnohé druhy Candida majú totožné alebo podobné' antigénne zloženie ako C. albicans, séro-logicky sú tažko rozlišitelné a na mikroorganizmy tejto sérologickej skupiny připadá až90 % všetkých kandidóz. Vzhl’adom na to, že mnohé Candida albicans sú silno patogénne, takich kultivácia za účelom přípravy imunologicky aktívnych polysacharidov sa musí robit zapřísné sterilných podmienok, čo zvyšuje náklady přípravy biomasy.

Preto je výhodné pre tieto účely použit kmen C. tropicalis, ktorý sa priemyslovo po-užívá na výrobu krmného droždia, je nepatogénny alebo len málo patogénny a naviac dobře sakultivuje na rOznych odpadných lignocelulózových materiáloch. Manán z C. tropicalis použi-tý ako imunosorbent zachytí protilátky séra homológzteho druhu ako aj Specifické látky vy-tvořené mikroorganizmami vOči manánom uvedenej séro-skupiny.

Sieťevanie polysacharidu z buniek kvasinkovitých mikroorganizmov je výhodné prevádzaťza takých reakčných podmienok, že optimálně množstvo sieťovacieho reagentu je 10 až 30 %hmot. na hmotnost suchého polysacharidu, pri koncentrácii 5 až 8 % hydroxidu sodného akoalkalického katalyzátoru a koncentrácia polysacharidu v reakčnom médiu má byt 15 až 30 %hmot. aby sa získal gél a nepdčacím objemom 4,5 až 8,0 ml/g polysacharidu. Sieťovanie jevýhodné viest najprv pri teplote 20 až 30 °C po dobu 1 až 2 hodin a v druhom stupni reakč-nú teplotu zvýšit na 50 °C pri ktorej teplote je reakcia ukončená za 1 hodinu. Zosietenýpolysacharid sa podrobí mokrej defibrácii v rýchloobrátkovej miešačke. Aby sa dosiahlaoptlmálna velkost častíc (80 až 250 mikrónov) obyčejné stačí doba 30 až 60 sekúnd podl’avýšky obrátok defibrátora. Před defibráciou je účelné do vodného média přidat kyselinuoctovú na neutralizáciu volných alkálií. Bez neutralizácie by sa získal velmi jemný gél,ktorý zle filtruje a nie je vhodný pre prácu na koloně.

Najvačšou výhodou nového postupu je však skutočnosť, že umožňuje připravit nový vyso-koúčinný imunosorbent, pomocou ktorého sa dajú izolovat v principe jednoduchým spdsobomžiadané protilátky z biologických materiálov, kterých izolácia inými postupmi je podstatnénákladnejšia a zložitejšia.

Nový postup mé Salšie výhody v tom, že používá nepurifikovaný polysacharid, ktorý pozosietenl mé dostatok volných imunologicky aktívnych skupin schopných efektívne viazaťprotilátky z biologických materiálov. fialšou podstatnou výhodou je, že mdže vychádzať i z nepatogénnych kmeňov, ktoré sapriemyslovo využívájú pře produkciu krmných kvasnic, čo podstatnou mierou zlepšuje ekono-mická stránku výrobného postupu. fialšie přednosti a detaily nového postupu sú zřejmé z príkladovej časti postupu, kto-ré nie je vyčerpávajúca, ale len demonštrujúca podstatné znaky nového postupu přípravy imu-nosorbenta vhodného na izolovanie protilátek proti mykotickým ochoreniam spfisobenými kva-sinkovitými mikroorganizmami rodu Candida. Přikladl 10 g surového, suchého polysacharidu izolovaného z buniek kvasinkovitých mikroorga-nizmov Candida tropicalis sa zvlhčí s 20 ml destilovanéj vody a nechá sa 5 až 10 minútnapučiavat. Potom sa přidá 4 ml hydroxidu sodného o koncentrácii 40 % hmot. dobré sa za- ·’mieša a nechá sa rozpúštať, až je roztok homogénny bez zjevných nerozpustných častíc, čoobyčajne netrvá viac ako 10 až 15 minút. Potom sa přidá 3 ml 1-chlór-2-3 epoxipropánu(epichlórhydrln) a dobré sa zamieša tak, aby sietovací reagent bol homogénne distribuovaný'v celom objeme reakčnej zmesi. Reakčnú baňku uzavrieme a necháme reagovat pri teplote la-boratória 1 až 2 hodiny, potom zvýšíme teplotu postupné na 50 °C a při tejto teplote nechá-me reakčnú zmes reagovat bez miešania 1 hodinu, načo zosietený polysacharidový gél mixuje-

Claims (4)

1. 221747 4 me vo vodě (do ktorej sa přidá kyselina octová na neutralizáciu volných alkálil) asi 30až 60 sekúnd v rýchloobrátkovom mixéri, na částice o velikosti 80 až 250 ju·· Nerozpustnýpolysacharidový gél sa niekoTkonásobne dekantuje od najjemnějších podielov, ktoré by velmizvyšovali odpor pri práci v koloně. Dekantované a dokonale premyté gélové Částice sa nafiltri odvodnia postupné etanolom, resp. acetónom a vysušia pri teplote do 60 °C. Napúčacíobjem připraveného imunosorbentu je okolo 6 až 7 ml/g a je vhodný pře imunosorbenciu pro-tilátok z biologických tekutin. Přiklad
2. 2 Postup podlá přikladu 1 s tým rozdielom, že pri sletováni použijeme polovlCná množstvovody, hydroxidu sodného a sietovacleho reagenta, priCom získáme polysacharidový gél s na-púčacím objemom 4 až 5 ml/g. Gél má lepšie hydrodynamické vlastnosti pri práci na koloněpri nezmenenej absorpčnej kapacitě protilátok. 4 Příklad
3. 3 Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom, že ako imunologicky aktívny polysacharid sapoužije polysacharid izolovaný z mikroorganizmu Candida albicans. Zosietený polysacharidmá obdobné vlastnosti ako zosietený polysacharid izolovaný z Candida tropicalis. Příklad
4. 4 · Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa pre sieťovanie použil 3-nésobne pre-Cietený polysacharid z Candida tropicalis. Roztok polysacharidu bol málo viskózny pri rov-nakej koncentrácii a velmi zle sa sletoval, mal vysoký napúčací objem po zosletení a pripráci na koloně sa CiastoCne rozpúštal. Pre lzoláciu protilátok sa ukázal ako nevhodný.Tento příklad slúži ako zrovnávací příklad, ktorý dokumentuje, že pre imunosorbenty jevýhodnější surový, nepurlfikovaný polysacharid z kvasInkovitých mikroorganizmov. Popí sáná. metoda přípravy imunosorbentov z mikrobiálnych polysacharídov je univerzálně,mdže byt použitá nielen pre kandidy, ale pře lubovolný imunologický aktívny polysacharid. Vynález má použitie v zdravotnictva pri dOkaze, izolácii a puriflkácii účinných pro-tilátok z biologického materiálu pri mykotických ochoreniach ako i v alergológii. P R E D Μ E T VYNÁLEZU Spísob přípravy imunosorbentov (imunoafinantov) z polysacharídov izolovaných z kva-siniek vyznačený tým, že polysacharid izolovaný z kvasinkovitých mikroorganizmov s výhodoudruhu Candida albicans alebo Candida tropicalis sa v prvom stupni zosietuje bifunkčnýmsitttovacím reagentoa s výhodou 1-chlór-2-3 epoxypropánom v množstve 15 až 30 % hmot. nahmotnost polysacharidu v alkallckom prostředí a v druhom stupni sa zosietený polysachari-dový gél podrobí vodnéj dispergácii vo vysokoobrátkovom mixéri za súčasnej neutralizácie .volných alkálil a v tretom stupni sa premyté nerozpustné polysacharidové částice odvodniana filtri etanolom a vysušia pri teplote do 60 °C. Severografia, n. p., MOST Cena 2,40 Kčs