CS219878B2

CS219878B2 - Způsob výroby glykosidů

Info

Publication number: CS219878B2
Application number: CS25077A
Authority: CS
Inventors: Mario Gosalvez
Original assignee: Mario Gosalvez
Priority date: 1977-01-14
Filing date: 1977-01-14
Publication date: 1983-03-25

Description

Vynález se týká způsobu výroby nových anthracyklinových glykosidů obecného vzorce IV (a)

ve kterém

Ri znamená skupinu —COCHs nebo· —COCHzOH , a alespoň jeden z dvojvazebných ligandů (aj, (bj a (c) je obsazen chelátovým kovovým kationtem zvoleným ze skupiny zahrnující Gd²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺, Go²⁺, Pb²⁺, Ni'²+, Cu²⁺, Hg²⁺, Fe³⁺ a Al³⁺.

Anthracyklinovými glykosidickými antibiotiky jsou sloučeniny, ve kterých tetrahydronaftacenový chromefor je vázán na cukr, nejobvykleji na bazický cukr. Jako reprezentanty takových antibiotik lze jmenovat následující laťky:

doxorubicin, deunorubicin, pyrromycin, rutilantin, cinerubin A, cinerubin B, aklavin, rhodomycin A, rhodomycin B, χ-rhodomycin 1, χ-rhodomycin 2, χ-rhodomycin 3, χ-rhodOmycin 4, isorhodomycin A, retikuliomycin A, doxorubininol, retikulomycin B, isochinocyklin A, galirubin, mycetin, mycetin A, vloíacin, α-citromycin, χ-citromycin, 10-desoxyrhodomycin, 0-isorhodomycin, χ-isorhodomycin, s-isorhQdomycin, minomycin, aqayamycin, ayamycin, nogalomycin.

Z těchto látek vzbudily široký zájem dóxorubicin (americký patentový spis číslo 3 590 028), deunorubicin (britský patentový spis č. 1 033 383), jejich deriváty a jiné analogy jako onkolyticky působící látky, tj. látky použitelné k léčbě leukémie a k jiné chemoterapii rakoviny. Struktura doxorubicinu je zřejmá ze vzorce I na přiložené tabulce vzorců), ve kterém znamená Ri skupinu —COCHaOH a R vlastní daunosaminylovou část molekuly, znázorněnou jako vzorec II na přiložené tabulce vzorců. Jestliže místo· toho Ri znamená skupinu —COCH3, vznikne strnkutra deunorubicinu. Byly připraveny četné analogy těchto sloučenin, hlavně obměnami hydroxymethylketonového zbytku doxo-rubiclnu, methylketonového zbytku deunorubicinu a aminoskupiny daunosaminylového zbytku u obou sloučenin. Reprezentanty těchto analogů popisují například americký patentový spis č. 3 686 136, K. Yamamoto a spol. ;v J. Med. Chem. 15, 872 (1973), západooněmec. patentové spisy č. 2 327 211, 2 557 537, 1 920 198, E. Bachman a spol. v Agents and Actions 574, 383, P, Chandra v Cancer Chemother. Rep. 6, 115 (1975), F. Arcamon a spol. tamtéž na str. 123, a G. Zbinden a spol. v Cancer Chemother. Rep. 4, 707 (1975), na které .se zde odkazuje. Rubidaaon lze uvést jako jeden zvláště zajímavý derivát, tj. sloučeninu vzorce I z připojené tabulky vzorců, ve kterém R má stejný význam jako- ve vzorci II na připojené tabulce vzorců a Ri znamená skupinu —-CCH31NNHCO—C6H5. Dalšími jsou doxorubicinol a daunorubicinol.

Jeden z problémů, který stále provází použití těchto onkolytických anthr.acykltn.ových glykosidů, vyplývá z jejich všeobecně vysoké hematologické, gestrointestinální a kardiální toxicity, která omezuje jejich širší použití v dávkách odpovídajících účinné chemoterapii rakoviny. Jako zvláště znepokojující se ukázala kardiotoxicita těchto látek. Vyznačená kardiotoxicita, často- smrtelná, provází použití doxorubicinu v kumulativních dávkách převyšujících 500 mg/m². Problém toxicity spojený s doxorubicinem nepochybně inspiroval četné pokusy o modifikaci této sloučeniny použitelným směrem, avšak nedávno, (v roce 1975) byla jedna skupina badatelů nucena učinit závěr, že „sloučenina, ve které je kombinována význačná i širokospektrální protinádorová účinnost adrlamycinu (doxorubicinu) s velmi nízkou srdeční -toxicitou, nebyla zatím nalezena“. (G. Zbinden a spol., Cancer. Chemother. Rep. 59, 707).

Při zkoušení kardiot-oxicity doxorubicinu -bylo- podle tohoto vynálezu shledáno, že je mohutným Inhibitorem adenosintrifosfatázy, ovlivňující transport sodíku a draslíku srdeční membránou, a že je tudíž inhibitorem transportu draslíku. Rovněž bylo shledáno, že tato inhibice je blokována vápníkem, což naznačuje, že doxorubicin vytváří komplex s vápníkem. Kumulativní kardiotoxicita doxo-rubicinu by byla vysvětlena, kdyby komplex doxorubicinu s vápníkem vy-tvořený v krvi -byl u adenosintrifosfatázy neúčinný, zatímco malý podíl volného glykosidů by byl v podstatě ireversibilně vázán na enzym. Autor tohoto vynálezu učinil závěr, že zcela nasycené mono-merní deriváty anthracyklinových derivátů s kovy, například deriváty obsahující kationty kovu, jehož afinita k vícevazehným ligandům glykosidů byla větší než vápníku, by nebyly kardiotoxické. Výsledná modifikace by mohla být současně nedostatečná k tomu, aby ovlivnila mechanismus onkolytické účinnosti látky, který může zahrnovat vmezeření d-o- DNK nádorových buněk. Ať je mechanismus účinku jakýkoli, a autor tohoto, vynálezu se nechce vázat na jakoukoli konkrétní teorii o účinku, připravil nyní deriváty anthracyklinových glykosidů s kovy, které, podržujíce si pro-tirakovinový účinek výchozích sloučenin, zřejmě pozbývají podstatně jejich charakteristické kardiotoxicity. Jak zde bude uvedeno dále, nové sloučeniny přinášejí další významné výhody.

Někteří pracovníci popsali komplexy kovů s anthracyklinovými glykosidy. Například D. W. Yesair se spol. v A. A. C. R. Abstr., 285 (1974J se zmiňují o tom, že adriamycin (doxorubicin) a deunomycin (daumoorubicin) tvoří komplexy s Fe²⁺, Co²⁺, Cu²⁺ a s dalšími kationty kovů. Tito pracovníci kombinovali Cu²⁺ s adriamycinem („A“) a daunomycinem („D“), přičemž pro posledně zmíněný uvádějí molární poměry Cu²⁺ : D (1:1) a činí závěr, že „ionty mědi chrání poněkud proti opožděné anthracyklinové toxicitě“. Další badatelé, kteří se pokoušeli později potvrdit tuto práci, shledali, že Yesairovou metodou se získává po-lymerní komplex 1:2: Cu²⁺ : D (50 % kationtu kovu zůstává mimo komplex), avšak in vivo- „dochází ihned k úplné diso-ciaci komplexu“. [K. Mailer a spol., Biochem. Pharm. 25, 2085 (1976).) Tito badatelé dospěli k závěru, že účinky pozorované dříve in vivo „nemohou být způsobeny přítomností chelátové formy těchto látek.“

Výsledkem výzkumu tohoto problému je způsob výroby nových antracyklinových glykosidů (obecného vzorce uvedeného v úvodu popisu tohoto vynálezu). Jeho podstata spočívá v tom, že se uvádí do- reakce jeden mol glykosidů, zvoleného ze skupiny zahrnující doxorubicin a daunorubicin, s alespoň jedním molem kovového kationtu zvoleného ze skupiny sestávající z Cd²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺, C-o?+, Pb²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Hg²+, Fe³⁺ a Al³⁺, načež se postupně zvyšuje pH vzniklé soustavy na hodnotu 6,5 až 7,5 za vzniku vzniklý -roztok se bezprostředně oddělí od případných pevných vedlejších produktů s obsahem kovu a zpracováním roztoku ihned p-o oddělení se zastaví další reakce mezi glykosidem a kovovým kationtem.

Výhodně se jako kovového kationtu používá kationtu zvoleného- že skupiny zahrnující Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺ a Co²⁺.

Při způsobu podle vynálezu se s výhodou postupuje tak, že se další reakce mezi glykosidem a kovovým kationtem zastaví zmrazením roztoku kapalným dusíkem.

Deriváty anthracyklinových glykosidů s kovem, připravené podle tohoto vynálezu, jsou v podstatě v monomerní formě (tj, jeden glykosid na jednu molekulu derivátu) a nežádoucí polymeraci, která může například zabránit vmezeření do DNK nádorových buněk, se v podstatě zabraňuje nový5

218878 mi způsoby, které potlačují aktivní přítomnosti volného kovu. Současně směsi podle tohoto· vynálezu výhodně obsahují více kationtů na jednu molekulu anthracyklinového glykosidu.

Způsob podle tohoto vynálezu se tedy týká způsobu slučování anthracyklinového glykosidu v roztoku, přičemž glykosid má alespoň jeden dvojvazebný ligand, a dvojmocného nebo trojmocného kationtů kovu, jehož afinita k ligandu je větší než u Ca²⁺; hodnota pH získaného systému se upravuje, aby se podpořila .tvorba chelátu kovu ,s dvojvazebnými ligandy; výsledný roztok se oddělí od pevného vedlejšího produktu obsahujícího kov; získaný roztok se ihned zpracuje, aby se zabránilo další reakci mezi glykosidem a. kationty kovu. Při izolaci může být rovněž odstraněno podstatné množství vedlejšího makromolekulárního polyglykosudického vedlejšího produktu. Nové sloučeniny připravené uvedeným způsobem se jeví v podstatě jako prosté kardiotoxicity, udržují si ještě onkolytickou účinnost vykazovanou výchozím glykosidem na bázi v podstatě srovnatelné (mg ku mg). Zavedení kovu do glykosidů mění spektra (viditelné, ultrafialové, infračervené a nukleárně-magnetické resonanční spektrum) výchozích sloučenin, což dokazuje změnu v molekulární struktuře antibiotik, způsobenou parciální povahou kovalenitní vazby, která je důsledkem interakce s kationty kovu. Rov také zřejmě snižuje katabolismus výchozí sloučeniny na toxické deriváty.

Deriváty kovů podle tohoto vynálezu mají ve srovnání s. výchozími onkolytickými sloučeninami významně sníženou všeobecnou, gastrointesitinální a hematologickou toxicitu. Zavedením kovu se mění elektronové vlastnosti výchozí sloučeniny a tak se zřejmě hluboce ovlivňují jejich permeabilní vlastnosti. Tak trojželezitý doxorubicin, který je výhodnou sloučeninou podle vynálezu, se jeví jako schopný pronikat hemaitoencefalickou i intestinální bariérou, zatímco u samotného doxorubicinu toho není v účinné míře schopen. Lze očekávat, že se takové vlastnosti projeví i v dalších provedeních tohoto vynálezu, takže sloučenin podle vynálezu může být použito k léčbě neoplastických chorob mozku a v některých případech mohou být podávány orálně, například v potahované formě. Dodatkem ke všemu předchozímu se zdá, že zavedení kationtů kovu význačně snižuje imunosupresivní vlastnosti příslušné výchozí sloučeniny. Tak například ve srovnávacích testech doxorubicin snižoval významně hmotnost sleziny a imunokompetentních buněk, zatímco trojželezitý doxorubicin připravený podle vynálezu se ukázal mnohem méně imunosupresivním. Konečně, když se sloučeniny připravené podle tohoto vynálezu aplikují parenterálně, zřetelně se odstraní nekróza v sousedství místa aplikace, která provází příslušnou výchozí sloučeninu, například doS xorubicín. Zdánlivě vyšší specificita onkolytických kovových derivátů podle tohoto vynálezu může být, jak je uvedeno výše, přisouzena změněným permeabilním vlastnostem. Ať je výhodnost mechanismu jakékoli, mělo by být zřejmé, že sloučeniny vyráběné podle tohoto vynálezu mají široké spektrum příznivých vlastností, které nemají příslušné výchozí sloučeniny.

O výhodných provedeních vynálezu může být snadno· diskutováno s odkazem Ua vzorec III připojené tabulky vzorců, kde je znázorněna struktura některých anthracyklinových glykosidů, pokud jde o pochopení trimetalických .anthracyklických glykosidů podle vynálezu. V popisovaném případě, jestliže znamená R atom vodíku a Ri skupinu —COCH3 nebo —COCH2CH, vznikají trimetalický daunorubicin a trimetalický doxorubicin. Jak bude odborníkům zřejmé, Ri může představovat různé deriváty a Rz může například obsahovat acylovou nebo· jinou skupinu. V každém případě bude zřejmé, že dvojvazebné ligandy výchozí sloučeniny jsou ve výhodném případě všechny obsazeny kovem („Me“). Jestliže se při výrobě sloučeniny podle vynálezu použije menšího množství kovové reakční složky, než je v podstatě potřebné k nasycení všech dvojvazebných ligandů výchozího glykosidů, bude výhodné, že kaition může být různě distribuován mezi ligandy jednotlivých glykosidů vytvářejících směs. V takových případech se o ligandech aglykonu předpokládá, že mají převahu v kompetici pro kation kovu. Při tvorbě sloučenin podle vynálezu se však nejvýhodněji dodává alespo n molů kationtů kovu na 1 mol glykosidu, přičemž n je počet dvojvazebných ligandů v molekule glykosidu. Nicméně za níže popsaných opatření může být použito stechíometrického nadbytku kationtů kovu. V případě glykosidů se třemi dvojvazebnými ligandy v molekule výsledné směsi obsahují výhodně alespoň 2 moly kovu na 1 mol glykosidu. Nejvýhodnější poměr kovu ke glykosidu v tomto případě je asi 3 : 1. Ačkoli, jak bylo dříve prohlášeno, nechci být vázán teorií, je možné, že neobsazené dvojvazebné ligandy výchozích glykosidů působí jako místa vazby pro inhibici Na-K-adenositrlfosfaitázy, takže je žádoucí věnovat pozornost tomu, aby bylo zajištěno jejich obsazení kovem.

V případě ilustrovaném na výkresu mají dvojvazebné ligandy anthracyklinonu (aglykonu) dlkarbonylovou povahu. Odlišný ligand se objevuje ve zbytku daunoisaminu, glykosylové hydroxylové skupiny. Samozřejmě jednotlivé anthracykllnové glykosidy, výhodně upotřebené podle tohoto vynálezu, mohou mít další druhy komplexotvorných ligandů. Rozmanité další dvojvazebné ligandy jsou popsány J. Kleinbergem v Inorganic Chemistry str. 218 až 220, D. C. Heath and Comp. Boston (1960), o čemž je zde pojednáno s odkazem na citaci.

Sloučeniny podle vynálezu se tvoří v roz219878 toku, výhodně vodném, kombinací výchozího· glykosidu a kationtu kovu dodávaného iv některé vhodné formě, s výhodou ve formě soli. Užívá se 'takových kationtů, jejichž afinita k ligandu je větší než u Ca²⁺, jak je stanoveno Hillovou metodou, například dvojmocných kationtů, jako Mn²⁺, Cd²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺, Co²⁺, Pb+², Ni²⁺, Cu²⁺ a Hg²⁺, a trdjmocných kationtů, například Fe³⁺ a Al³⁺. Výhodné kationty zahrnují Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺a Co²*, Fe³⁺ jsou obzvláště výhodné. Výhodné reakční složky solí kovů zahrnují chloridy, sírany a dusičnany, ačkoli lze použít rovněž hydroxidů.

Obvykle, když se reagující složka kovu nejprve kombinuje ve vodném roztoku, má výsledný systém poměrně kyselou reakci. Protože rozpouštění reagující složky kovu je uskladněno· při kyselém pH, dávám přednost nastavit nejdříve hodnotu pH na hodnotu blízkou neutralitě, aby došlo k deprotonacl dvojvazebných ligandů a podpořila se tvorba chelátů kationtů. Je žádoucí, aby reakční systém byl upraven v rozsahu hodnoty pH postačující k podpoře tvorby cheláfů, s výhodou blízko neutrálnímu prostředí, například na hodnotu pH asi od 6,5 asi do 7,5, zvláště výhodně asi od 6,8 až do 7,2. Oprava hodnoty pH by měla být postupná, aby se snižovalo srážení pevné sloučeniny kovu, o jejíž přítomnosti se domnívám, že vede ke tvorbě neúčinných zbytků obsahujících polyglykoisid.

Reakční teplota se řídí se zřetelem k rozpustnosti (spodní hranice) a teplotě degradace jednotlivého použitého anthracyklinu (horní hranice). Teplota se udržuje obvykle během upravování hodnoty pH v rozmezí asi od 15 až asii do 50 °C.

Po upravení hodnoty pH je žádoucí, aby se získané vcelku monomerní deriváty obsahující kov rychle oddělily od pevných vedlejších produktů obsahujících kovy, například filtrací. Většina glykosidických zbytků obsažených ve filtrátu je v monomerní formě. jak bylo zjištěno technikou ultrafiltra.ce, je ve výhodných provedeních podle vynálezu více než asi 95 % a optimálně více než 99 % glykosidu obsaženého ve filtrátu v monomerní formě. Výsledný roztok, který stále obsahuje malé množství nekomplexovaných rozpustných kationtů kovů, se potom okamžitě zpracuje, aby se zabránilo další reakci kov—glykosid, která by mohla vést ke tvorbě neúčinných materiálů obsahujících polyglykosidy, o kterých se předpokládá, že mají složení dříve známých směsí, například takových popsaných výše Yesairem. Volný kov by mohl být absorbován například uhličitanem hořečnatým nebo odstraněn pomocí chpomatografie. Zfiltrovaný roztok se zejména výhodně po případném dávkování jednoduše a rychle ztuží rychlým zmrazením. Rychlým zmrazením zfiltrované reakční směsi se tak účinně blokuje další reakce sloučeniny glykosidu s kovem, ke které by jinak mohlo docházet. Potom se produkt s výhodou lyofilizuje a uchovává při nízké vlhkosti, neijvýbodněji nižší než asi 1 %.

Lyofilizovaný materiál, který bude obvykle obsahovat větší podíl maniitu nebo další přísady, by měl být užíván parenterálně, zásadně bezprostředně po provedené rekonstituci, například sterilní vodou do konečné koncentrace, například - ml/2,5 mg anthracyklinového glykosidu obsahujícího •více kovu. Sloučeniny, jako například trojželezitý doxorubicin, mohou být podávány orálně, popřípadě v potahované formě.

Zatímco· výhodný způsob výroby anthracykllnového glykosidu obsahujícího kov podle tohoto vynálezu je ten, který je uveden výše, tj. uvádění do reakce dříve připraveného. anthracyklinového glykosidu, například doxorubicinu nebo· daunorubicinu, s příslušnou reagující složkou soli kovu, je pochopitelné, že tvorbu chelátu je možné uskutečnit rovněž jako jeden z konečných stupňů syntetického postupu anthracyklinového· glykosidu, aniž se ve skutečnosti izoluje volný anthracyklinový glykosid jako takový.

Dalšími možnými látkami využitelnými v tomto vynálezu jsou anthracyklinové glykosidy, jejichž glykosidický zbytek se liší od obvykle vázaných zbytků k danému anthracyklinonu (aglykonu), jak to· probíhá u Streptomyeetes při tvorbě glykosidu. Takové aníthracyklinové glykosidy se vyrábějí uváděním příslušného anthracyklinanu, například daunorubicinonu, do reakce s příslušným alkylačním činidlem, jako to· popsal Penco v Chim. Ind. (Milán) 50, 908, (1968); C. A. 70, 1953; francouzský patentový spis č. 2 183 710. Vhodnými alkylačními činidly jsou 2,3,4,6-tri-O-acetyl-a-D-glukOpyranosylbromid; 3,4,6-tri-O-acetyl-2-desoxy-2-trifluoracetamidO’a-Dnglukopyranosylbromid; di-(N-trifluoracetyl-a-daunosamin).

Takovými reakcemi lze převádět aglykony zde jmenovaných .anthracyklinových glykosidů v širokou paletu různých anthracyklin'ových glykosidů. Daunosaminové zbytky daunorubicinu a doxorubicinu lze nahradit například rhodosamiinem nebo jinými bazickými cukry.

Cheláty kovu zde popisované mohou prokázat užitečnost rovněž při kontrole iontů stopových prvků, zejména s přihlédnutím k jejich schopnosti sloužit jako zdroje stopových kovů pro takové účely, jako je růst rostlin. Cheláty kovu Fe³⁺ by mohly mít zvláštní význam při využití k ošetření chlorosy železa nebo deficitu u rostlin. Množství použitého žélezitého chelátu by mělo být stanoveno· pomocí obsahu dostupného železa v určité půdě, ve které rostliny rostou. Množství použitého žélezitého chelátu by mělo stačit k vyloučení chlorotických podmínek po· dobu 1 až 2 týdnů. Sloučeniny by kromě toho mohly rovněž sloužit jako stabilizátory různých systémů, například plas219878 tických hmot odvozených, od viinylidenchloridu, kde stopy chloridu zvyšují nestáloot plastické hmoty. V takových systémech by měl být chelát kovu použít v koncentracích postačujících k překonání účinků maximálního: množství chloridu, který by mohl být uvolněn.

Účelem následujících příkladů je vynález objasnit, nikoli omezovat, protože na stejné bázi a 3 použitím podstaty tohoto vynálezu je možné mnoho dalších příkladů.

Biochemická a farmakologická .studie produktů podle tohoto vynálezu

Níže, v tabulce; I, jsou uvedeny disociační konstanty doxorubicinu a daunorubiciinu s různými kovy. Kovy jsou uvedeny v pořadí

TABULKA I

Disociační konstanta derivátu doxorubicinu a daunorubícinu

Kov s kovem

Fe³⁺	5 x 10-7 _M
Hg²⁺	—
Cu²⁺	1 x 10~θ M
Al^3h	—
Ni²⁺	—.
p_b ² +	—
Co²⁺	1,3 x 10-5 _M
Zn²⁺	—.
_Fe2+	3,5 x 105 _M
Cd²⁺
Mn²⁺	__

své obecné afinity k tvorbě chelátů. Pro některé z meh byla vymezena konstanta. Jak je uvedeno, trojmocné železo je kov s nejvyšší afinitou k doxorubicinu a -daunorubícinu a vápník je kov s nejnižší afinitou. Disociační konstanta byla vypočtena Hillovou metod-ou, která využívá barevné změny během tvorby -derivátů antibiotik s kovem. Uváděná disociační konstanta se týká v každém případě nejeilnější interakce lignad—-kov. V dalším se odkaz na afinitu kovu k některému danému glykosidickému „ligandu“ v případě glykosidu s více ligandy týká t-oh-o, který představuje, jak je stanoveno Hillovou hodnotící metodou, nejsilnější interakci ligami—kov. V tabulkách „M“ znamená mol na, litr.

Disociační konstanta derivátu doxorubicinu ,a daun-orubicinu

Ko-v s kovem

Ca²⁺ 12,7 x ΙΟ“⁵ M

Mg²⁺ —

Pokus z tabulky I ukazuje, že kovy s- nejvyšší afinitou k doxorubicinu a daunorubicinu jsc-u Fe³⁺ a Cu²⁺ a žě Co²⁺ a Ca²⁺mají nejnižší -afinitu. Ostatní kovy musí mít vzhledem ke své poloze v tabulce intermedíární afinitu.

V tabulce II je vysvětlen, vliv doxorubicinu, železitého doxorubicinu 2:1a železitéiho doxoruhici-nu 3 :1 na účinnost adenosintrifosfatázy, enzymu závislého na sodíku a draslíku, izolovaného z králičího srdce.

TABULKA II

Procento účinnost a-denosintrifosfatázy, závislé na -sodíku a draslíku v přítomnosti vzrůstajících koncentrací anthracy-klinů

Koncentrace [%)

Látka	O.M	10-13 M	10-11 M	10-9 M	10-7 M	ΙΟ“³ M
doxo-rubicin	100	65	40	25	25	25
Fe³⁺-doxo-rubicin 1 : 1	100	80	60	60	60	60
Fe-²⁺-doxorubicin	100	100	100	100	100	100
Fe^,2+-doxorubicin	100	100	100	100	100	100

Pokus z tabulky II ukazuje, že doxorubicin je význačným inhibitorem Na-K-a-denosintri-fosfatázy, které je patrně v úzkém vztahu ke kardiotoxicitě. Železité cheláty doxoru-bicinu v poměru 2:1 a 3:1 jso-u proti enzymu zcela neúčinné, zatímco železitý derivát 1 : 1 doxorubicinu vykazuje parciální inhibiční účinky. Z těchto- skutečností lze na základě výsledků z tabulky I odvodit, že kovový derivát doxorubicinu vytvořený s kovem v po-měru 2 : 1 nebo vyšším postrádá inhibiční účinky pro-ti Na-K-adenosintrifoiSta-táze, to znamená, že by neměl být kardlotoxic-ký. Podobná práce ukázala, že r-ovněž deriváty daunorubícinu -s kovem neinhlhují Na-K-a-denosintrifosfatázu. Lze očekávat, že -ostatní zde popisované cheláty se mohou c-hov-at obdobně. Bylo například prokázáno, že následující analo-gy doxorubicinu inhibují Na-K-adenosintri-fosfatázu. U jejich příslušných derivátů kovů, připravených dříve uveným způsobem popsaným pro do-xoru-bicin, lze očekávat význačné snížení kar-dio,toxicity. Sloučeniny mají strukturu I a II uvedenou v tabulce vzorců, kde R má stejný význam jako ve vzorci III a Ri má udaný význam.

TABULKA III

Analoga

Rubidazon

NSC-219977

NSC-221264

NSC-227013

NSC-219976

NSC-237638

NSC-236672

NSC-234740

NSC-233854

NSC-211391

NSC-221266

NSC-237672

NSC-216071

NSC-221265

Rl —C=N—NHCO—CeHs \

CH3 —C=N—NH—CO—CeHáCl

CHs —C=N—NH—CO—CeHiOH \

CH3

CHs /

—C=N—NH—CO—CeHá—N \ \

CH3 CH3 —C=N—NH—CO—C6H4OCH3 \

CH3 o

Z —C—O—CH3 —C=N—NH—CO—C6H4 pH \

CHs —C=N—NH—CO—CH6H4O—(CH2)2—CH3

CHs —C=N—NH—CO—CeHá—Li \

CH3 —C=N—NH—CO— (CH2)3—CHs \

CH3 —C=N—NH—CO—CeHí—Cl \

CIÍ3 —C—N—NH—CO—C6H4—Cl \

CH3 —C=N—NH—CO—CeHs \

CH2OH —,c=N—NH—CO—CeHí— NO2 \

CH3

Koncentrace 50% inhibice

Na-K-adenosintrifosfatázy IO-11 m

10-11 M

10-ιθ m

10-1° M

10-θ m

ΙΟ“⁹ M

ΙΟ“⁸ M

ΙΟ“⁷ M

10-θ M

10-6 M

10-5 _M

10-5 m

Tabulka IV objasňuje srovnání mezi doxo- působení na syntézu DNK v buňkách myší rubicinem a Fe³⁺-doxorubicinem 2,5 :1 při s leukémií 1210.

219873

14

TABULKA IV

Procento' inhibice syntézy DNK při stoupajících koncentracích anthracyklinu Koncentrace [ %)

Látka 0 μΜ 3 μΜ 5 μΜ 7,5 μΜ 10 μΜ doxorubicin 0 železitý doxorubicin (2:5:1) 0

Pokus z tabulky IV ukazuje, že železité deriváty vykazují stejný inhibiční efekt na syntézu DNK jako výchozí antibiotikum a tudíž, že protinádorová účinnost, která je založena na inhibici syntézy DNK, je u derivátu s kovem zachována.

V tabulce V se srovnává toxicita doxorubicinu a železitého doxorubicinu. Tento po60 68 75 90

70 80 90 kus byl prováděn se vzorky železitého doxorubicinu připraveného' s různými poměry železa k antibiotiku, většími než 2 :1, a každý vzorek vedl k podobným výsledkům.

Látky byly podávány pouze jednou intraperitoneální injekcí skupině 10 myší .a po 8 dnech byl hodnocen počet přežívajících zvířat.

TABULKA V

Procento přežívajících myší po podání anthracyklinů

Dávky (%)

Látka 10 mg/kg 20 mg/kg 30 mg/kg 40 mg/kg 50 mg/kg 60 mg/kg doxorubicin 100 60 železitý doxorubicin 100 100

100 70 40

Tento pokus ukazuje, že železitý doxorubicin je mnohem méně toxický než doxorubicin. Po grafickém znázornění dat z tabulky IV se vypočte, že průměrná smrtelná dávka použitého železitého doxorubicinu je 47 mg/kg.

Tabulka VI ukazuje terapeutickou účinnost železitého doxorubicinu u myší s leukémií P-338. V tomto pokuse byl použit železitý doxorubicin vyráběný s různými poměry kovu k antibiotiku, včetně poměru 2 :1 a většího, a ise všemi se dosáhlo podobných výsledků. Průměrné přežívání bylo hodnoceno ve skupině 10 myší inokulovaných 100 000 leukemických buněk a léčených první den po inokulaci stoupajícími dávkami doxorubicinu a železitého doxorubicinu.

TABULKA VI

Dny průměrného přežívání leukemických myší

Látka

Dávka (i. p. dny) mg/kg 4 mg/kg 8 mg/kg 12 mg/kg 24 mg/kg 36 mg/kg doxorubicin 11 50 železitý doxorubicin 11 50

Pokus z tabulky VI dokazuje, že železitý doxorubicin má u leukemických myší terapeutický účinek ekvivalentní doxorubicinu, lze 'jej však užívat v důsledku nízké toxicity ve vyšších dávkách. Protože v důsledku limitující toxicity nelze u lidí dosáhnout s doxorubicinem optimální léčebné dávky, železitý doxorubicin představuje v důsledku své nízké toxicity zřetelný terapeutický pokrok.

V tabulce VII jsou objasněny elektrokar-

! 42	6	4
i 42	35	23
diografické změny ně po intravenózní vek doxorubicinu a	následující bezprostředinjekci stoupajících dáželezltého doxorubicinu

: 1 králíkům.

Tento pokus ukazuje, že po železitém doxorubicinu nedochází k významným změnám elektrokairdiogramu, zatímco po· doxorubicinu dochází k intenzívním změnám, a to je dokladem chybějící kardiotoxicity železitého doxorubicinu.

21S873

TABULKA VII

Elektrokardiografioké změny

Dávka

Látka	5 mg/kg	10 mg/kg	15 mg/kg	20 mg/kg	30 mg/kg
doxorubicin	zvýšená T-neg. vlna	T-vlna	neg. T. široký QRS	neg. T široký iQRS Aryťmie	neg. T široký QRS bradykardická arytmie
železitý doxorubicin		žádná	(žádná	bez významných změn	bez významných změn

Tabulka VIII ukazuje viditelné a infračervené spektrální charakteristiky doxorubicinu a železitého doxorubicinu (3:1).

TABULKA Vlili

Optická absorpce procenta transmitance při různých vlnových délkách (%)

Vlnová délka cm'¹ ÍL730 1020 1590 1585 1570 600 480 280

doxo-
; rubicin	30	>50	0
železitý doxo- rublcin	10	23	20
Z tabulky	VIII lze	pozorovat,	že komple-

xy ive srovnání s volnými sloučeninami vykazují při různých vlnových délkách různé absorpce a že mají rovněž různá absorpční maxima.

0 0 0,180 0,200

37 0,080 0,100 0,360

Tabulka IX ukazuje srovnání hematologické toxicity doxorubicinu a železitého doxorubiclnu (3 : 1).

TABULKA IX

Hematologická toxicita anthracyklinových derivátů (počet leukocytů/mm³)

Den

Látka	Dávka (mg/kg)	0	7
doxorubicin	10	4,700	3,300
	20	4,700	2,400
železtiý doxorubicin	10	4,700	5,100
	15	4,700	4,400
	20	4,700	4,400
	30	4,700	3,600
	40	4,700	3,800
	50	4,700	2,800
	60	4,700	1,800
Lze pozorovat, že po	železitém doxorubi- trojmocným železem, mědí a	kobaltem jsou

činu se až do koncentrací větších než 50 mg/kg nedosahuje hematologické toxicity pozorované po aplikaci 20 mg/kg doxorubicinu.

Biochemická a farmakologická studia uvedená v tabulkách I až IX závěrem ukazují, že doxorubicin daunorubicin tvoří chelátové deriváty se všemi kovy uvedenými v tabulce I, že tyto chelátové deriváty kovů vytvořené obzvláště stálé; a že tyto chelátové deriváty kovu vzniklé z kovu a antibiotika v poměru 2 :1 nebo větším jsou neúčinné proti Na-Kzávislému enzymu adenosintrifosfatáze, méně toxické u myší a králíků a terapeuticky aktivní leukémie myší. Ačkoli většina pokusů, které byly demonstrovány, byla provedena s železitým doxorubicinem s různými poměry kovu k antibiotiku (2:1 nebo vět219878 ším), výsledky s chelátovými deriváty kovu obou antibiotik s různými kovy v různých poměrech jsou podobné.

Příklad 1

Železitý doxorubicin (trojželezitý doxorubicin)

100 mikromolů doxoruhicinu a 300 mikromolů chloridu železitého se smísí za stálého míchání ve vodném roztoku při teplotě místnosti v baňce opatřené registrujícím pH-meitrem. Po styku železa s antibiotikem se začíná tvořit komplex a hodnota pH se nastaví pomalu koncentrovaným hydroxidem sodným na 7,3. Roztok se upraví vodou na koncentraci 1 mg doxoruhicinu v 1 ml a při hodnotě pH 7,3 .se přidá tris-hydroxymethylaminomethanový pufr do konečné koncentrace 12 mM. Roztok se poté rychle zfiltruje 0,22mikronovým sterilním filtrem. Potom se roztok ihned přenese do malé baňky, zmrazí tekutým dusíkem a lyofilizuje. Lyofilizovaný prášek se isterilně uzavírá do ampulek obsahujících 10 mg, které se rekonstituují bezprostředně před použitím pomocí 10 ml vody.

Podobně lze uvádět do· reakce s chloridem železitým jiné anthracyklinové glykosidy za vzniku příslušných železitých chelátů.

Příklad 2

Železitý doxorubicin (3,5 : lj

Používá se způsobu z příkladu 1, avšak za použití 350 mikromolů chloridu železitého a reakční teploty 42 °C.

Příklad 3

Železitý doxorubicin (2,5 : 1 j

Používá se způsobu z příkladu 1, avšak za použití 250 mikromolů chloridu železitého a nastavení hodnoty pH na 6,9.

Příklad 4

Železitý doxorubicin (2:1)

Opakuje se způsob z příkladu 3 za použití 200 mikromolů chloridu železitého, čímž se získá derivát kovu v poměru 1 : 2.

Příklad 5

Železitý doxorubicin (1 : 1 j

Používá se způsobu z příkladu 1, avšak za použití 100 mikromolů hydroxidu železitého.

použití síranu měďnatého namísto chloridu železitého.

Příklad 7

Kobalitnatý doxorubicin

Používá se způsobu z příkladu 1, avšak za použití chloridu kobaltnatého namísto· chloridu železitého.

Z předchozího budou odborníkům jasné další možnosti, kterými lze získávat sloučeniny podle tohoto vynálezu. Například v některém z předchozích způsobů lze doxorubicin nahradit monochlcrhydrátem daunorubicinu. Lze opět použít jiných polárních rozpouštědel než vody, například deriváty kovů mohou vznikat kombinací kationtu a glykosidu v alkoholu za současného míchání a s vyloučením vzduchu. Podobně může být použito četných reakčních složek obsahujících kov jiných, než je chlorid železitý. Například:

TABULKA X

Zástupci solí obsahujících kov použitelných podle vynálezu

FeSCU

CuSOá

NiClz C0CI2 Alz( SO4)3

HgClž

ZnSO4

Cd(NO₃)2

Pd(OCOCH3)2

Pb(NO3)z

Když se sloučenin podle vynálezu používá k léčbě rakoviny, podávají se v onkologicky účinných množstvích, obvykle v kombinaci s fyziologicky neškodným nosičem. Například trojželezitý doxorubicin a trojželezitý daunorubicin mohou být podávány pacientům trpícím neoplastickými chorobami v dávkách pohybujících se asi od 40 až asi do 250 mg/m² povrchu těla v intervalech mezi asi 1 až 3 týdny. Obvykle jsou tyto sloučeniny indikovány k použití u všech rakovin, u kterých se používá odpovídajících výchozích glykoGidů, a u dalších druhů rakoviny, kde deriváty prokázaly účinnost dík svým nových vlastnostem permeability (například v mozku).

Tabulka vzorců

Příklad 6 Mědnatý doirairufaicin

Používá se způsob z příkladu 1, avšak za

Claims

pRedmEt

1. Způsob výroby glykosidů obecného vzorce IV ve kterém

Ri znamená skupinu —COCHs nebo — COCHžOH a alespoň jeden z dvojvazných ligandů (a),

VYNALEZU (b) a (c) je obsazen chelátovým kovovým kationtem zvoleným ze skupiny zahrnující Cd²+, Fe²⁺, Zn²+, Co²⁺, Pb²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Hg²⁺, Fe³⁺ a. Al³⁺, vyznačující se tím, že se uvádí do reakce jeden mol glykosidů, zvoleného ze skupiny zahrnující dexorubicin a daunorubicin, s alespoň jedním molem kovového kationtu zvoleného· ze skupiny zahrnující Cd²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺, Co2+, Pb²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Hg²⁺, Fe³⁺ a Al³⁺, načež ise postupně zvyšuje pH vzniklé soustavy na hodnotu 6,5 až 7,5 za vzniku monomerních glykosidů s obsahem kovu, vzniklý roztok se bezprostředně oddělí od případných pevných vedlejších produktů s obsahem kovu a ihned po oddělení se zastaví další reakce mezi glykosidem a kovovým kationtem.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že ise jako kovového· kationtu používá kationtu zvoleného· ze skupiny zahrnující Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺ a Co·²⁴.
3. Způsob podle bodu 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se další reakce mezi glykosldem a kovovým kationtem zastaví zmrazením roztoku kapalným dusíkem.