CS219575B1 - Sposob přípravy chromogénneho substrátu na testovanie Ci zložky celulázovej aktivity - Google Patents

Description

219 57S (54] Spfisob přípravy chromogénneho substrátu na testovanie CT zlomkyceiulázovej aktivity 1

Vynález sa týká sposobu přípravy chro-mogénneho substrátu na testovanie Ci zlož-ky ceiulázovej enzýmovej aktivity.

Stanovenie Ci zložky ceiulázovej aktivitysa doposial' robí podlá zdíhavej gravi-metrické] metody (Halliwell G.: Biochem. J.79, 1985/1961), ktorá spočívá v tom, že re-akčné médium obsahujúce Cx zložku celulá-zovej aktivity sa nechá za štandardnýchpodmienok inkubovať s filtračným papieromdostatočne dlhý čas a potom sa filtračnýpapier vyperie od hydrolyzo,váných rozpust-ných produkte v enzýmovej hydrolýzy, pa-pier sa vysuší a zváží a z úbytku na váběsa vypočítá enzýmová aktivita Ci celulázypřítomná v testovacom médiu alebo sa roz-puštěná celulóza stanoví vo filtráte oxidač-ně s dvojchromanom (Selby K., Maitland C.C.: Biochem. J. 104, 716/1967). Táto metoda je hlavně z časového hra-diska velmi zdlhavá a pre sériové analýzyhlavně při nízkých aktivitách sledovanéhoenzýmu nevhodná. V posledných rokoch sa na polysacharid-hydrolázové enzýmové aktivity používá súspechom chromogénny polysacharidovýsubstrát, kto-rý po enzýmovej hydrolýze pro-dukuje farebný filtrát, intenzita ktorého jeúměrná prítomnej enzýmovej aktivitě.

Na tomto principe sú známe zahraničněi čs. chromogenné substráty Phadebas Amy-lase Test, (Clinical and technical Informa-tion, Almquist, Wiksells Boktryckeri (1979),A. O. č. 192 202, A. O. č. 192 210), ktoré saúspěšně používajú najma v klinickej praxipri stanovení aktivity alfa-amylázy v bio-logických tekutinách pre diagnostické účely.

Doposial' známa příprava chromogennéhosubstrátu pre celulázovú aktivitu připravo-vala sa zdlhavým a energeticky náročnýmpostupom, tak že sa prášková hydroceluló-za připravená pomocou kyseliny fosforečnejvyfarbovala pri 50 °C s farbivom Remazolbriliant blue za použitia 200 % síranu sod-ného na hmotnost hydrocelulózy pri pH 11za použitia fosforečnanu sodného (A. O.Stamm: Helv. Chim. Acta 46, 3008 1963).

Takto připravený substrát je však vhodnýhlavně pre Cx zložku ceiulázovej aktivitya nie prezložku Ci ceiulázovej aktivity.

Obdobný sposob přípravy založený na far-bení filtračného papiera Whatman 1 (Poln-celot R. P., Day P. R.: Appl. Microblol. 23,5, 875/1972] je rovnako energeticky nároč-ný, lebo pracuje až pri 100 °C.

Pri selekcii mikroorganizmov produkujú-cich Cx zložku ceiulázovej aktivity je po-třebné mať vefmi presnú a rýchlu metoduna stanovenie C! zložky ceiulázovej aktivi-ty, aby bolo možné priedežne sledovat opti-málně kultivačně podmienky resp. hodnotitspoíahlivo vysokoprodukčné mutanty. V pre- 2 vádzke je to důležité pri riadení priemyslo-vej kultivácie pre maximálnu produkciu Ciceiulázovej aktivity.

Preto sme vypracovali podmienky prepřípravu chromogénneho substrátu spožadovanými vlastnostami vysokéj - cit-livosti na celulázovú aktivitu, čo jepredmetom novej přihlášky vynálezu. /

Podstata vynálezu spočívá v tom, že mik-rokryštalická celulóza z drevnej celulózys výhodou z bavlny sa nechá v prvom stup-ni reagovat 30 minut pri teplote 15 až 30 °Cv 5 až 7-násobnom hmotnostnom množstvevodného roztoku zloženia 0,7 až 1,5 % hmot.hydroxidu sodného a 5 až 10 % hmot. oc-tanu sodného alebo síranu sodného za stá-lého miešania, načo v druhom stupni sapřidá 5 až 10 °/o hmot. farbiva s výhodoudvojsodnej soli kyseliny 8-amino-5-(-3/sulto- etylsulfonyl/anilino)-6-antrachinonsulfono-vej a nechá sa pri teplote· 15 až 30 °G reago-vat 1 až 3 hodiny, a v treťom stupni sa chro-mogénna mikrokryštalická celulóza dokona-le vymyje od -nezreagované-ho farbiva naj-prv vodou, potom postupné zriedeným eta-nolom až koncentrovaným etanolom aleboacetónom a vysuší vofne na vzduchu alebovákuovo pri 60 až 70 °C.

Najvhodnejším substrátom pre C} celulá-zovú aktivitu je celulóza s maximálnymkrystalickým podielom a preto je na tentoúčel najvhodnejšia mikrokryštalická celu-lóza připravená parciálnou kyslou hetero-gennou hydrolýzou bavlny. Představuje náj-čistejšiu celulózu s mlnimálnymi podielmiextraktívnycli látok, popola a podielomamorfnej celulózy maximálně 10 až 15 °/o. Můžu sa však použit i mikrokryštalickécelulózy připravené zo zušfac-htených drev-mých-buničím najlepšie s-- minímálnyrú ob-sahom ligninu (nie vyšším ako 0,1%). Op-timálny polymeračný stupeň použitých mik-rokryštalických celulóz je 150 až 250. Po-lymeračný stupeň pod 100 nie je vhodnýpre horšiu filtrácíu pri enzýmovej analýzei vlastně] přípravě farebného substrátu.

Optimálně množstvo farbiva aplikovanédo reakcie je okolo 10 % na hmotnost su-chej mlkrokryštalickej celulózy. Pri nižšíchmnožstvách je substrát nedostatečné citlivýpři enzýmovej reakcii á pri vyšších množ-stvách sa substrát zle filtruje a premývaa tiež klesá kryštalický podiel celulózy, tak-že je dobrým substrátom i pre zložky Cscelulázu. Účinnost reakcie viazania farbiva na mik-rokryštalickú celulózu je 50 až 70 % a re-akcia prebieha dostatočne rýchlo pri labo-ratórnej teplote, pri ktorej nedochádza kudegraůácii celulózovej substancie v alkalic-kém prostředí.

Ako elektrolyt zvyšujúci účinnost viazania

Claims (1)

1. 219 575 farbiva na celulózu je výhodné používaťoctan sodný, ktorý sa lepšie vymývá z pro-duktu ako síran sodný, najma ked sa pre-mýva koncentračným gradientom etanoluresp. acetonu. Výhodou postupu podl'a vynálezu je, že:umožňuje prvýkrát připravit chromogén-ny substrát vhodný pre sériové meranie en-zýmovej aktivity zložky Ci celulázy spek- . trofotometrickou metodou, spósob přípravy chromogenného substrá- tu je technologicky a energeticky nenáročný,chromngénny substrát je stabilný a móžesa skladovat neobmedzený čas v suchom stave, na jedno stanovenie aktivity zložky Cicelulázy postačuje 50 až 100 mg chromo-génneho substrátu, mikrokryštalickým chromogénnym substrá-tom možno stanovit i nízké zložky Ci celu-lázovej aktivity v pťiebehu do 2 hodin. Příklad 1 100 g mikriQkryštalickej celulózy z bavlnysa nechá reagovat 30 minut při izbovej tep-lotě v 500 ml vody, v ktorej sa predomrozpustilo 5 g hydroxidu sodného a 50 goctanu sodného. Potom sa po častiach doreakčnej zmesi přidává 10 g farbiva dvoj-sodnej soli kyseliny 8-am.ino-5-(-3/sulfoetyl- sulfonyl/anilin]-6-antrachinonsulfonovejtak, aby sa pridávanie ukončilo do 30 mi-nut. Reakená zmes sa mieša pri laboratór-nej teplete po dobu 2 hodin, potom sa při-dá 7 ml konc. kyseliny octovej a reakčnázmes sa odfiltruje a na filtri premýva naj-prv destilovanou vodou, potom postupnézmesou vody a etanolu so stúpajúcim kon-centračným gradientom etanolu alebo ace-tonu tak dlho, až je filtrát bezfarebný. Pre-mytý chromogénny substrát sa vysuší volnéna vzduchu alebo za vákua při teplete 60 až70 °C. Výsledný produkt obsahuje 5 až 7 % viazaného farbiva a je dobrým substrátonpre zložku celulázovej aktivity. Příklad 2 Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielomže sa do reakcie aplikuje 5 g farbiva. Výsledný produkt obsahuje 3 až 3,5 % viazaného farbiva, t. j. takmer o polovicimenej citlivý na rovnakú aktivitu Ci zložkjcelulázy. Příklad 3 Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielomže ako pomocný elektrolyt sa použije 50 £síranu sodného. Výsledný produkt má podobný obsah viazaného farbiva ako v příklade 1. Příklad 4 Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielomže ako póvodná celulóza sa použije mikro-kryštalická celulóza z bukovej sulfátové]celulózy zušlachtenej celulózy používané]pre viskózové vlákna. Výsledný produkt obsahuje 5,5 % viaza-ného farbiva. Příklad 5 Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom,že ako celulóza s-a použije mikrokryštalickácelulóza zoi smrekovej zušlachtenej sulfito-vej celulózy s pQlymeračným stupňom 220,ktorá velmi dobré filtruje pri spracovaní. Obah farbiva v hotovom substráte je 6 °/o. Vynález má použitie pri sériových ana-lýzách přesného a rýohleho stanoveniazložky celulázovej aktivity pri šlechtěnímikroorganizmov produkujúcich Ci zložkycelulázy a v priemyslovej kultivácii mikro-organizmov produkujúcich uvádzané enzý-my. PREDMET VYNALEZU Spósob přípravy chromogénneho substrá-tu na testavanie Ch zložky celulázovej akti-vity význačný tým, že mikrokryšta-lická celulóza z drevnej celulózy s výhodouz bavlny sa v prvom stupni nechá reagovat30 minut pri tep lote 15 až 30 °C v 5 až 7-násobnom hmotnostnom moožstve vodnéhoroztoku zloženia 0,7 až 1,5 % hmot. hydro-xidu sodného1 a 5 až 10 % hmot. octanusodného alebo síranu sodného za stáléhomiešaníia, načo sa v druhom stupni přidá5 až 10 % hmot. farbiva s výhodou dvoj- sodnej soli kyseliny 8-amino-5-(-3/sulfoetyl-sulíonyl/anilino) -6-ántrachinonsulfionovej nahmotnost mikrokryštaliekej celulózy a ne-chá sa pri teploto 15 až 30 °C reagovat podobu 1 až 3 hodiny a v treťom stupni sachromogénna mikrokryštalická celulóza do-konale vymyje od nezreagovaného farbivanajprv vodou, potom postupné zriedenýmetanolom až koncentrovaným etanolom ale-bo acetónom a nakonlec sa premytý produktvolné vysuší na vzduchu alebo vakuové priteplote 60 až 70 °C. SOUP 1194-84