CS218702B1 - pósob vysokokapacitnej imobilizácie proteínov - Google Patents

Description

Vynález sa týká spósobu vysokokapacitnej imo-bilizácie proteínov na modifikovaném pektíne.

Kovalentnáimobilizácia proteínov na polysa-eharidy vyžaduje v prvom radě vhodná aktiváciupolysacharidu. Jeďným z často používaných spóso-bov je zavedenie karboxylových skupin. Tak jetomu napr. v případe komerčných karboxymetyl-rderivátóv. celulózy (CM-celulózy Lovosa, What-man), agarózy (CM-SepharoseR),. alebo sletova-ných dextránóv (CM-SephadexR C). Takéto kar-boxylové deriváty možno po aktivácii karbodiimi-dom priamo použit na imobilizáciu proteínov.Váčšinou je však vhodnejšie previesť ich na hydra-zidy, résp. azidy či až izokyanáty.

Zavedenie karboxylových skupin ako jeden zošpósobov aktivácie polysacharidov nie je ovšempotřebné, ked polysacharid už tieto skupiny obsa-huje. Tak je tomu v případe sieťovanej kyseliny ipektovej, ktorá sa připraví sletováním pektínuepichlórhydrínom v alkalickom prostředí (V. Ti- Jbenský, E. Kuniak, Čs. patent 140 713 [1971]),Takto sieťované kyselina pektová je makroporéz-nym, gélovitým materiálom s napučiavacím obje-mom (n. o.) vo vodě 4 až 14 ml/g. Stupeňnapučiavania možno nastavit yofbou podmienok|sieťovania. Sletovaná kyselina pektová má vysokýstupeň substitúcie karboxylovými skupinami, DS~ 1. Už v takejto formě, s využitím karbodiimidov,možno použit sieťovanú kyselinu pektovú akonosič pre kovalentnú imobilizáciu proteínov. Dal-šie možnosti dává prevedenie sieťovanej kyselinypektovej na hydrazidy, resp. dalej na azidy. ZatiaTčo hydrazidové deriváty umožňujú výhodné viazaťglykoproteíny cez ich cukomé zlóžky, azidy viažuproteiny cez ich polypeptidický reťazec.

Podstata spósobu vyspkokapacitnej imobilizácieproteínov, v ktorom sa v prvom stupni pektín alebovodorozpustná sof kyseliny pektovej zosieťujev alkalickom prostředí 2-chlórmetyl-oxiránom,spočívá v tom, že sa v druhom stupni aktivujúkarboxylové skupiny karbodiimidmi, hydrazínhydrátom či hydrazín hydrátom a potom dusita-nom sodným v přítomnosti kyseliny sofnej a v tre-ťom stupni sa využitím známých metod prevedienaviazanie proteinu. {

Pre uvedené postupy imobilizácie proteínov jévhodná slabo zosieťovaná kyselina pektová(s epichlórhydrínom), s napúčacím objemom (n. Íi.) ^4 ml H2O/g resp. 3,7 ml metanolu/g. Takýto;él. ibá totiž vysoký vylučovací limit pre proteinyaž áo molekulovej hmotnosti 80 000). Tiež pripríprave jej derivátov, napr. hydrazidov, možnodosiahnuť až DS 0,42, pričom zvyšok karboxylo-vých skupin je vo formě esteru. é Výhodou navrhovaného spósobu vysokokapa-Čitjnej imobilizácie proteínov na vodonerozpustnéderiváty kyseliny pektovej je, že — základný materiál (pektín) je fahko dostupný iprirodný biopolymér - pri sieťovaní sa pektín súčasne deesterifikuje— sieťovaná kyselina pektová má DS Ni, čo r 218702

í umožňuje tiež připravit jej ďalšie deriváty s výso-kýmiDS — v súvislosti s predchádzajúcim možno připra- vit preparáty s vysokým obsahoni proteínov (do100 mg proteínu/g nosiča) „ · — sieťovaná kyselina pektová, jej deriváty ako ajpreparáty s mobilizovanými proteínmi sú gélovitémateriály s dobrými hydrodynamickými vlastnos- ; tami — umožňuje vyrábať preparáty z lacných surovin |pomeme jednoduchým technologickým postu- iporn. Příklady vyhotovenia Přikladl

Ku 20 g pektínu (citrusového) sa přidalo za -stálého miešania 13 ml 25%-ho NaOH a nechalo/sa reagovat po dobu 1 h pri 20 °C. Přidalo sa 1,8 mlepichlórhydrínu a po 2 h miešania pri 20 °C sapostupné, vpriebehu 1 h, zvýšila teplota na 40 °C.Pri tejto teplete sa nechá reagovat ešte 1 h. ;Zosietená sodná sof kyseliny pektovej sa postupnépremyla vodou, etanolom a vysušila pri teplote60 °C. Sletovaný pektan sodný sa pomaly premyl0,25 N HC1, dalej vodou do negatívnej reakcie na jchloridy, etanolom a-nakoniec sa vysušil na vzdu-chu. 200 mg sieťovanej kyseliny pektovej (n. o. 14 'ml H2O/g) sa resuspendovalo v 15 ml 1,5 % !roztoku N-cykloňexyl-N'-/N-metyl-morfolinp/ ;/etyl/-karbodiimid-p-toluénsulfonátu v destilova- 1nej vodě okyslenej na pH 4,8 a suspenzia samiešala po dobu 1 h pri izbovej teplote. Aktivova-ný gél sa dokladné premyl vodou a přidal sak roztoku 10 mg acetylcholínesterázy (acetylcholín * hydroláza, EC 3.1.1.7; 25,4 U-mg) v 8 ml deštilo- j- vanej vody. Suspenzia sa miešala po dobu 2 h pp0—2 °C. Po filtrácii a premytí nerozpustnéhopodielu 100 ml 2 M NaCl· vykazovala mobilizova-ná acetylcholínesteráza špecifickú aktivitu 5,8U/mg a preparát mal celková aktivitu 71,3 U/g. Priskladovaní vo zvlhčenom stave pri 4 °C sa pozoro-val v priebehu 6 mesicaov 15%-ný pokles kataly-tickej aktivity. Příklad 2

Sieťovaná kyselina pektová (1 g) připravená akoý příklade 1, sa suspendovala v 100 ml metanolu, . přidalo sa 0,6 ml kóncentrovanej HC1 a refluxovalohod. Po premytí metanolom a vysušení sapródukt (0,95 g) řesuspendoval v zmesi 16,6 mlmetanolu a 16,6 ml 99 % hydrazín hydrátu.Suspenzia sa udržiavala 72 hod pri 38 °C zaobčasného premiešania a po zachytení na sklenejírite premyla 0,15 M NaCl do negatívnej reakcie na tdrazín, 250 ml vody, 250 ml etanolu a produkt sasušil. Hydrazid sieťovanej kyseliny pektovej(0,28 g) obsahoval 4,13 % dusíka. K roztoku 0,5 g ;l^ktozylovaného hovádzieho sérového albuminuΛ01ΟΟ ml 0,1 M acetátového pufru pH 5 sa přidalo40 mg jodistanu sodného a nechalo stát 1,5 hodw hne pri izbovej teplote.. Po přidaní 0,15 mléfedenglykolu sa nechalo stát dalších 0>5 hod za ,

Claims (1)

1. 4 í' istých podmienok. Zmes sa dialýzovala 2 hodi v.trne proti 2 x 51 50 mM octanovéhópufru pH 5. * 0*25’g hydrazidu sieťovanej kyseliny pektovej sa:^©suspendovalo v oddialyzovanej zmesi, pH sa!uprjavilo na 6,5 a nechalo sa miešať 24 hod pri ί izbovej teplote. Preparát sa premyl 250 iftl vody, ;i 500 ml 0,1 M borátového purfu pH 8,5 obsahujúř-!čeho 1,075 M NaCl a Tween 20 (0,1 % v/v), odsál,řesuspendoval v známom objeme a skladoval pri4 °C. V případe dlhšieho skladovania sa přidalakvapka chloroformu alebo ažid sodný do koncen-írácie 0,1 % (w/v). Preparát obsahoval 85,5 mg Albumínu/g sieťovanej kyseliny pektovej. i - Příklad 3 ·. Sieťovaná kyselina pektová (n. o. 4 ml H2O/g) sa I připravila ako v příklade 1, s tým rozdielom, že sapoužili 4 ml epichlórhydrínu a reakčná doba priizbovej teplote sa predížila o 2 h. Hydrazid$eťovanej kyseliny pektovej (0,59 g; 7,21 % . aúsíka) sa potom připravil postupom uvedenýmv příklade .2. 10 mg pseudocholínesterázy (10 * jednotiek) (acylcholín acyl hydroláza,EC 3.1.1.8) * sa rozpustilo v 2 ml 20 mM fosfátového pufru pH8 a přidal sa 1 ml 4,35 mM roztoku jodistanu ; draselného v tom istom pufri. Reakčná zmes saudržiavala po dobu 5 h pri 4 °C, potom sa enzýmdvakrát prezrážal 10-násobným nadbytkom etano-lu. Prezrážaný enzým sa rozpustil v 100 ml 20 mM'fosfátového pufru pH 8 a k roztoku sá přidalo 0,5 gf hydrazidu sieťovanej kyseliny pektovej. Suspenziasa miešala po dobu 18 h pri 4 °C. Po premytí 100 ml20 mM NaCl, 200 ml destilovanej vody a 100 ml 20mM fosfátového pufru pH 8 vykazovala imobilizo-vaná pseudocholínesteráza špécifickú aktivitu 1^,6U/mg a preparát mal úhmnú aktivitu 23 U/g? 218702 Preparát sa skladoval tak, ako je uvedené v príklá- de 1. ‘ ' { Příklad 4 Postupovalo sa ako v příklade 3, s tým rozdie-lom, že sieťovaná kyselina pektová (n. o. 7,4 jnlH2O/g) sa připravila podlá příkladů 1 s tým, že saha sieťovanie použili 3 ml epichlórhydrínu. Prepa-rát obsahoval 72,6 mg albumínu/g sieťovaneji kyseliny pektovej. í - I f ' ' ' Ί Příklad 5 ;. ρ Hydrazid sieťovanej kyseliny pektovej (0,25’ připravený postupom uvedeným v příklade 2 sa resuspenduje v 10 ml 0,6 NHC1 ochladenej nay0 °C. V priebehu 20 min sa za stálého miešania/pomaly přidá 1,25 ml 5 % vodného roztoky'dusitanu sodného. Mieša sa dalších 20 njin, stálepri 0 °C. Azid sa premyje 100 ml íadovej Vody, 50ml fadovéíio 1 M NaCl, znovu 100 ml íadovej vody„ a odsaje. K čerstvo připravenému azidu sieťovanej:f kyseliny pektovej sa přidá ochladený roztok 0,1 g/hqvádzieho sérového albuminu v 10 ml vody./Okamžité sa upraví pH na 8,7 nasýteným rozto-kom tet raboritanu sodného. Suspenzia sa mieša 20min naTadóvom kúpelizakontrolovaniapH. Akjéto nutné, pH sa doupraví na 8,7. Potom sa! suspenzia mieša ešte dalších 40 min. Produkt saí premyje 10Q mj vody, 200 ml 1 M NaCl, 100 ml 50mM kyseliny octovej, 100 ml 1 M NaCl, 100 ml 0,5 ŘNaHCOš, 100 ml 1 M NaCl, 200 ml vodyá odsaje. Imobilizovaný enzým sa řesuspendovalvo vodě a skladoval ako je to uvedené v příklade 2.Preparát obsahoval 104,8 mg albumínu/g sieťova-nej kyseliny pektovej. PREDMET VYNÁLEZU I Spósob vysokokapacitnej imobilizácie proteí-nov, pri którom sa v prvom stupni pektíri alebovodorozpustná sol kyseliny pektovej zosieťujev alkalickom prostředí 2-chlórmetyloxiránom vy-značujúci sa tým, že sa v druhom stupni aktivujú karhoxylové skupiny s karbodiimidmi hydrazínhydrátom, či hydrazín hydrátom a dusitanomsodným v přítomnosti kyseliny soFnej a v treťomstupni sa s využitím známých metód preyedienaviazanie proteinu. Cena: 2,40 K i s Vytiskly Moravské tiskařské závody, provoz 12, Leninova 21, Olomouc