CS218019B1 - Způsob přípravy 3-(RS)-(adenin-3-yl)mléčné kyseliny - Google Patents

Abstract

Předmětem vynálezu je způsob přípravy 3-(RS j - (adenin-9-yl)mléčné kyseliny. Výchozí látka 9-(2,2-dialkoxyethyl)adenin se uvede do reakce ve vodném roztoku postupně s 1,2 až 1,5 ekvivalenty, počítáno na látku vzorce II, minerální kyseliny při teplotách 50 °C až 100 °C po dobu 1 až 6 hodin, se 4 až 6 ekvivalenty, počítáno na látku vzorce II, kyanidu sodného nebo draselného při pH 6 až 7 a teplotách 0 °C až 30 stupňů Celsia po dobu 12 až 24 hodin, as minerální kyselinou výsledné koncentrace 4 mol.l“* 1 až 6 moLto1 při teplotách 100 °C až 120 C° po dobu 5 až 6 hodin a poté se produkt izoluje ionexovou chromatografií a krystalizací.

Description

Předmětem vynálezu je způsob přípravy

3-(RS j - (adenin-9-yl)mléčné kyseliny.

Výchozí látka 9-(2,2-dialkoxyethyl)adenin se uvede do reakce ve vodném roztoku postupně s 1,2 až 1,5 ekvivalenty, počítáno na látku vzorce II, minerální kyseliny při teplotách 50 °C až 100 °C po dobu 1 až 6 hodin, se 4 až 6 ekvivalenty, počítáno na látku vzorce II, kyanidu sodného nebo draselného při pH 6 až 7 a teplotách 0 °C až 30 stupňů Celsia po dobu 12 až 24 hodin, as minerální kyselinou výsledné koncentrace 4 mol.l“^{* 1} až 6 moLto¹ při teplotách 100 °C až 120 C° po dobu 5 až 6 hodin a poté se produkt izoluje ionexovou chromatografií a krystalizací.

213019 . -Předmětem .vynálezu je způsob přípravy 3í(RŠ)--(adenin-9-yl)mléčné, kyseliny vzorce

NH_Z

I

CH_ZCH-COOH

OH (I)

9-(ω-Karboxyalkyl)deriváty adeninu, které obsahují v postraním řetězci hydroxylové skupiny, mají řadu významných biologických vlastností, jako např. protivirovou nebo hypolipidemickdu účinnost. Významným účinkem těchto· látek, především tzv. eritadeninů [ 4- (adenin-9-yl ] -2,3-dihydroxymáselných kyselin] je silná irreversibilní inhibice enzymu S-adenosyl-L-homocysteinhydrolasy, který katalyzuje hydrolýzu S-adenosyl-L-homocysteinu (SAH) na adenosin (Ado) a L-homocystein (HCys) i obrácenou reakci, a který má významnou roli při regulaci biologických methylací:

SAH Ado + HCys

Inhibice tohoto enzymu, který je přítomen téměř ve všech druzích tkáně, umožňuje potenciálně zasahovat do průběhu některých dějů v živé hmotě (replikace virů, spermatogenese, oogenese, apod.).

Podobný silný inhibiční účinek jako eritadeniny mají na S-adenosyl-L-homocysteinhydrolasu i obě stereoisomerní (R- a S-j-3-(adenin-9-yl) mléčné kyseliny. Tyto látky byly dosud získávány podle literatury jako minoritní vedlejší produkty oxidace 5-(adenin-9-yl) -5-deoxy-D-ribofuranosy, -L-arabinofuranosy nebo -D-arabinofuranosy [Kawazu M. a další, ). Org. Chem. 38, 2887 (1973); Kanno T., Kawazu M., Chem. Pharm. Bull. 22, 2836 (1974)].

Výtěžek těchto reakcí je nízký, izolace čistých produktů obtížná a výchozí látky jsou dostupné mnohastupňovými postupy.

Tyto· nedostatky odstraňuje předmětný vynález přípravy 3-(adenin-9-yl) mléčné kyseliny vzorce I, jehož podstatou je, že se 9-(2,2-dialkoxyethyljadenin vzorce II

CH^CHIOR^ (ll>

kde R je methyl nebo ethylskupina, uvede do reakce ve vodném roztoku postupně s 1,2 až 1,5 ekvivalenty (na látku II) minerální kyseliny při teplotách 50 °C až 100 °C, se 4 až 6 ekvivalenty (na látku II) kyanidu sodného nebo draselného při pH 6 až 7 a teplotch 0 °C až 33 °C, poté s minerální kyselinou výsledné koncentrace 4 mol.l^-1 až 6 mol.I^-1 při teplotách 100 °C až 120 °C a produkt se izoluje Ionexovou chromatografií a krystalizaci z vody.

Výchozí látkou pro přípravu látky vzorce I je sloučenina vzorce II, snadno a v dobrých výtěžcích dostupná reakcí acetalů bromacetaídehydu s adeninem (Doel Μ. T., Jones A. S., Taylor N.: Tetrahedron Letters 1969, 2285). Hydrolýzou této látky vzniká sůl adenin-9-ylacetaldehydu, která bez izolace poskytuje ve vodném roztoku za podmínek kyanhydrinové synthesy, tj. reakcí s alkalickým kyanidem při neutrálním pH v prakticky kvantitativním výtěžku 3-(adenin-9-yl)-2-hydroxyprppionitril.

Tento intermediát se opět bez izolace převede na surovou látku vzorce I kyselou hydrolýzou. Průběh reakce není ovlivněn ani charakterem acetalové skupiny výchozí látky vzorce II, ani druhem použité minerální kyseliny nebo kyanidu. Reakce se provádí v jediné reakční nádobě, bez izolace meziproduktů, ve vodném prostředí a bez nároků na speciální zařízení.

Surová reakční směs obsahuje vedle minerální kyseliny a její sodné nebo draselné soli prakticky pouze látku vzorce I, která může být snadno vyčištěna ionexovou chromatografií: směs se nejprve váže na silně kyselém katexu, který se promyje vodou do ztráty kyselé reakce eluátu a amonná sůl látky vzorce I je uvolní elucí zředěným vodným amoniakem. Odparek této soli se pak adsorbuje na středně bazický anex a malé množství neutrálních UV-absorbujících nečistot se vymyje z ionexu vodou. Látka vzorce I se pak uvolní těkavou organickou kyselinou (s výhodou kyselinou mravenčí) a po odpaření eluátu se vyčistí krystalizaci z vody s přídavkem aktivního uhlí. Produkt, který se získá ve výtěžcích vyšších než 70 proč. na použitou látku vzorce II, je zcela homogenní podle elektroforesy a chromatografie.

Inhibiční účinek racemické sloučeniny vzorce I na S-adenosyl-L-homocysteinhydrolasu z krysích jater se prakticky neliší od parametrů obou čistých stereoisomerů, takže lze tyto nesnadno dostupné látky racemickou sloučeninou vzorce I zcela nahradit. Látka vzorce I vyvolává rychlou irreversibilní inaktivaci uvedeného enzymu v mimořádně nízkých koncentracích (10^-7 mol.l¹).

V dalším jsou postupy podle vynálezu a biologická účinnost osvětleny v příkladech provedení, aniž se tím jakkoliv omezují. Příklad 1

Suspenze 5 g (0,02 mol) 9-(2,2-diethoxy218019 ethyl) adeninu ve 100 ml 0,3 mol.I^-1 kyseliny chlorovodíkové se vaří pod zpětným chladičem 3 hodiny, ochladí se ledem, přidá se 5,9 g (0,12 mol) kyanidu sodného a směs se zneutralizuje kyselinou octovou. Suspenze se míchá 6 hodin při 0 °C a 20 hodin při 25 °C, přidá se koncentrovaná kyselina chlorovodíková na výslednou koncentraci 4 mol.l^-1 (67 ml) a směs se vaří 5 hodin pod zpětným chladičem. Pak se směs odpaří ve vakuu, oddestiluje třikrát 50 ml vody a odparek ve 100 ml vody se vnese na sloupec 300 ml Dowexu 50 x 8 (H⁺-forma).

Sloupec se eluuje nejprve 1 1 vody a potom 1 litrem 2,5 % amoniaku. Amoniakální eluát se odpaří ve vakuu a zbytek v 50 ml vody se vnese na sloupec 200 ml Dowexu 1 x 2 (acetátová forma). Sloupec se eluuje vodou (2,5 lj, ionex se pak míchá 2 h s 500 ml 1 mol.l'¹ kyseliny mravenčí, odsaje se a ionex se promyje 2 1 vroucí vody. Spojené filtráty se odpaří ve vakuu a zbytek se krystaluje ze 100 ml vroucí vody (s přidáním 1 g aktivního uhlí). Krystalizací při 0 °C se získá produkt, který se odsaje, promyje vodou, ethanolem, etherem a vysuší ve vakuu. Výtěžek 2,7 g (60 %) bílého krystalického produktu vzorce I, který netaje do 260 °C. Elektroforetická pohyblivost při pH 7,5 (vztaženo na uridin-3‘-fosfát) : 0,45. R_F 0,40 (2-propanol-konc. amoniak-voda, 7:1:2).

Příklad 2

K suspenzi 0,03 mol 9-(2,2-dimethoxyethyl) adeninu ve 150 ml vody se přidají 4 ml kyseliny solné a směs se vaří pod zpětným chladičem 1 hodinu. Ochladí se ledem, přidá za míchání 7,8 g (0,12 mol) kyanidu draselného, neutralizuje kyselinou octovou (cca 6 ml) a míchá při 0 °C 2 hodiny a 20 Tabulka I hodin při teplotě místnosti. Pák se přidá 200 ml kyseliny solné a směs se vaří pod zpětným chladičem 6 hodin. Směs se odpaří ve vakuu a zbytek se čistí na ionexech stejně, jako je uvedeno v příkladu 1. Získá se 5,0 g (75 %) látky vzorce I shodné podle chromatografie a elektroforesy s preparátem podle příkladu 1.

P ř í k 1 a d 3

Stanovení inhibičního účinku látky vzorce I na S-adenosyl-L-homocysteinhydrolasu z krysích jater bylo provedeno v inkubační směsi, která obsahovala (A) pro sledování synthesy SAH 80 mmol.I^-1 fosfátový pufr (podle Sorensena) pH 7,37, 2,4 mmol.l^-1 dithiothreitol, 3 mmol.l*¹ L-homocystein, 2.10^-5 mol.l^-1 [^CJ-adenosin, 40 ^g/ml SAH-hydrolasy a látku vzorce I v koncentracích 4.10'^s až 10“⁶ mol.l^-1; (B) pro sledování hydrolýzy SAH obsahovala směs 60 mmol.l^-1 fosfát draselný pH 7,37 (podle Sorensena), 0,1 mmol.l^-1 EDTA, 4.10^-6 mol.l^-1 [^KlC]-SAH, 40 gg/ml S-adenosyl-L-homocysteinhydrolasy, 1,6 IU/ml adenosindeaminasy a 10^-8 až 2.10^-7 M látku vzorce

I.

Reakční směs byla inkubována 10 minut při 37 °C a substrát a produkty reakce byly rozděleny papírovou chromatografií v soustavě 2-propanol-konc. amoniak-voda (7 :

: 1 : 2).

Skvrny látek byly vystřiženy a radioaktivita stanovena kapalnou scintilací. Grafickým zpracováním byly zjištěny hodnoty IC50 (koncentrace látky vzorce I vyvolávající 50 proč. snížení rychlosti sledované reakce), které jsou uvedeny v tabulce I. Obdobně byly stanoveny i hodnoty IC₅₀ pro (Sj- a (Rj-enantiomery látky vzorce I.

IC₅₀ pro S-adenosyl-L-homocysteinhydrolasu z krysích jater

Reakce Synthesa Hydrolýza

Látka IC₃₀ (l/Sj₅₀ IC₅₀ (I/Sj₅₀ [10^-7 mol.l^-1} [ΙΟ^-2] [10^-8 mol.l^-1] [10~²J (Sj-I 8,9 4,45 5 1,25 (Rj-I 4,2 2,10 2 0,5 (RSj-I 4,7 2,35 3,4 0,85

IC₅o znamená koncentraci látky vzorce I vyvolávající snížení počáteční rychlosti reakce na 50 %'.

(I/S J_so znamená poměr molárních koncentrací inhibitoru a substrátu při 50% inhibici enzymové reakce.

Claims (1)

1. vynalezu

   Způsob přípravy 3-(RS)-(adenin-9-yljmléčné kyseliny vzorce I kde R je methyl nebo ethylskupina, uvede do reakce ve vodném roztoku postupně s

   I, 2 až 1,5 ekvivalenty, počítáno na látku vzorce II, minerální kyseliny při teplotách 50 °C až 100 °C po dobu 1 až 6 hodin, se 4 až 6 ekvivalenty, počítáno na látku vzorce

   II, kyanidu sodného nebo draselného při pH 6 až 7 a teplotách 0 °C až 30 °C po dobu 12 až 24 hodin, a s minerální kyselinou výsledné koncentrace 4 mol.l^-1 až 6 mol.l^-1 při teplotách 100 °C až 120 °C po dobu 5 až 6 hodin a poté se produkt izoluje ionexovou chromatografií a krystalizaci z vody.

   vyznačený tím, že se 9-(2,2-dialkoxyethyljadenin vzorce II

   NH, vy

   CHjCHtOR^ tm wS

   k.