CS215289B1 - Způsob stanovení aflatoxinů radioimunologickou analýzou - Google Patents

Abstract

Vynález se týká způsobu stanovení aflatoxinů rádioimunologickou analýzou, při které se jako tritiovaného radiollgandu použije (2,3—3H) aflatoxinů—B2 vzorce I. Způsob umožňuje stanovení plkogramových množství všech aflatoxinů jako celku vyskytujících se v biologických materiálech.

Description

Uvedené plísně a jejich toxické metabolity se vyskytují v nejrůznějších zemědělských a potravinářských produktech při běžném způsobu zpracování a skladování (seno, sláma, zrniny, krmná moučka a granuláty, mouka, sušené mléko apod.). Z těchto produktů přecházejí mykotoxiny do zvířat, kontaminuji mléko, maso a transplacentárrtě přecházejí dokonce i do mláďat. Závažná je skutečnost, že tyto mykotoxiny se vyskytují ve velmi, nízkých koncentracích a že příznaky, které vyvolávají, jsou všeobecné, jako je snížená spotřeba potravy a poruchy růstu. Toxický účinek dosahuje LDso u aflatoxinu-Bi 1 až 10 mg/kg živé váhy zvířete. Prahové dávky kancerogenního účinku aflatoxinu—Bi jsou 5 /ug/kg pro krysu a 0,1 /ug/kg pro pstruha.

Geografická, distribuce aflatoxinu—Bi je velmi rozdílná; nejvyšší koncentrace byly nalezeny v něterých tropických oblastech (100 až 1000 /ug/kg), pro Evropu se uvádí hladina 50 až 150 /ug/kg. Aflatoxln—Bi je chemicky relativně stálá sloučenina, varem v neutrálním prostředí se prakticky nemění a dekontaminace je velmi obtížná.’ Sledováni hladiny aflatoxinu—Bi je problém nejen potravinářsko veterinářský, ale i epidemiologicko - zdravotnický.

Problém detekce a kvantitativního stanoveni aflatoxlnů je řešen již řadu let. Většina dosud užívaných metod stanoveni je založena na detekci nebo kvantitativním vyhodnoceni v UV oblasti. To však předpokládá již jejich odděleni od velkého množství interferujících látek. Nejnovější fyzikálně- chemické metody chromatografické, kombinované s fluorescenční ^etekcl, dovolují stanovit pomocí mlnikolon 70 ng aflatoxinu—Bi ve vzorku (Holaday Ch. a Landseň J., Agrlcultural Food Čhemistry 23, 1134 (1975)) nebo 0,5 /ug/kg metodou vysokotlaké kapalinové chromatografie (Altex Chromatogram 1, 1-5 (1978)), nebo subpikogramová množství metodou vysokotlaké kapalinové chromatografie kombinovanou s laserovou detekci (Dlebold G. J., Zare R. N.; Science 196, 1439 (1977)) a tenkovrstvou chromatógrafií 2 /ug/kg (Balzer J.; L. Assoc. Off. Anal. Chem. 61

584 (1978)). Uvedené metody mají své nevýhody, protože jsou pracné, dlouhotrvající a vyžadují velké množství výchozího vzorku pro extrakci. Dále postrádají citlivost a specifitu pro stanovení stopových množství aflatoxinů v biologických tekutinách a tkáních, kde je množství vzorků často limitováno.

Nové možnosti stanovení aflatoxinů v nejrůznějších biologických materiálech poskytují radioimunologické metody. První radiolmunologlcké stanovení aflatoxinu— Bj popsali Langone a Van Vunakisová (J. Nat. Cancer Inst. 56, 591 (1976)). Imunlsací králíků konjugátem aflatoxinu—Bi získali tito autoři protilátky a pomocí nespecificky tritiovaného aflatoxinu— —Bi o specifické aktivitě 4,0 Ci/mmol vypracovali postup pro kvantitativní stanovení. Citlivost jejich metody je 75 pg/0,1 ml aflatoxinu-Βι, v rúžných biologických materiálech.

Podobný postup popsali Chu a Ueno (Appl. Environment. Mlcrohiology 33, 1125 /1977/), kteří použitím nespecificky tritiovaného aflatoxinu-Βι o specifické aktivitě 13 Cl/mtnol dosáhli citlivosti pouze 2Q0 až 2000 pg v 0,5 ml kapalného vzorku.

Citlivost každé metody radlotmunoanalýzy je limitována specifickou aktivitou použitého radlollgandu. Trltiace na základě výměnné reakce, aplikovaná v případě aflatoxinu—Bi, nemůže zaručit specifické aktivity alespoň 25 Ci/mmol, minimálně vyžadované pro stanovení organických sloučenin metodou radioimunoanalýzy.

Uvedené nedostatky odstraňuje způsob stanovení aflatoxinů radloimúnologlckou analýzou podle vynálezu, jehož podstatou je, že jako tritiovaného radloligandu s použije (2,3—Ή) aflatoxinu—B2 vzorce I,

který se dá připravit o specifické aktivitě minimálně 30 Ci/mmol a jehož použitím při stanovení aflatoxinů metodou radioimunoanalýzy se dá zvýšit citlivost této metody až na 6 pg/0,1 ml vzorku.

Dále jsou uvedeny příklady použiti (2,3—^SH) aflatoxinu—B2 jako radlollgandu při stanovení aflatoxinů v biologických materiálech. ₍

Příklad 1

Stanovení aflatoxinu v mléce

Vzorek mléka (asi 10 ml) se homogenlsuje zahřát ím na 60 °C ,na vodní lázní za promíchávání.

• Ze vzorku se odpipetuje do 5 ml aglutinační zkumavky 10 _zul, přidá se 100 ,ul protilátek (při ředění 1:3000) a 100 /Ul roztoku fritiovaného radioligandu (2,3—³H) aflatoxinu—B2 o celkové aktivitě 5—8000 1/min. Obsah zkumavky se promíchá a nechá ikubovat pří 4 °C do druhého dne.

1 5 2 8 9

Zkumavka se přenese do ledové lázně, přidá se 0,5 ml 0,3% vodní suspenze aktivního uhlí (Nořit), promíchá se a obsah se centrifuguje (asi 600 g) 10 minut. Do lahvičky pro měření radioaktivity, obsahující 5 ml scintilačního roztoku, se odpipetuje 0,5 ml supernatantu a změří se radioaktivita na nukleárním počítači. Změřená radioaktivita vzorku byla 1700 i/min, čemuž odpovídá podle grafu 30 pg aflatoxilnu. Uvedený graf kalibrační křivky je znázorněn na přiloženém výkrese, kde na ose x je uvedeno množství aflatoxinu v pg a na ose y radioaktivita vzorku vyjádřena v impulsech/min.

Celý postup se provádí dvojmo a z průměrné hodnoty stanovené radioaktivity se určí obsah, aflatoxinu odečtením z kalibrační křivky, připravené známým způsobem, uvedené na grafu.

Příklad 2

Stanovení aflatoxinu v krmivá g krmivá se extrahuje 100 ml směsi aceton : voda (80:15) po dobu 30 minut. Pevné zbytky se oddělí filtraci nebo centlfugacl a rozpouštědlo se odpaří k suchu. Zbytek se rozpustí ve 2 ml metanolu a alikvotní podlí 10 /ul se přidá do 2,5 ínl fosfátového. pufru 0,05 M a pH 7,5 s přídavkem 3% hovězího sérového albuminu.

Vlastní stanovení se provádí stejným způsobem jako v příkladu 1, ale s použitím⁷100 /ul takto připraveného roztoku. Změřená radioaktivita vzorku byla 1200 i/min, čemuž odpovídá podle grafu 118 pg aflatoxinu.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob stanovení' aflatoxlnů radiolmunologickou analýzou, vyznačený tím, že jako tritiovaného radioligandu se použije (2,3—³H) aflatoxinu—B2 vzorce I