CS214543B1

CS214543B1 - Způsob přípravy rozpustného preparátu acetylcholinesterázy

Info

Publication number: CS214543B1
Application number: CS39781A
Authority: CS
Inventors: Josef Zabransky; Jirina Marhoulova
Original assignee: Josef Zabransky; Jirina Marhoulova
Priority date: 1981-01-20
Filing date: 1981-01-20
Publication date: 1982-04-09

Abstract

Mozková tkáň se homogenizuje při teplotě -10 až -20 °C v organickém rozpouštědle rozpouštějícím lipidy, poté se nerozpustný zbytek zůstávající po homogenizaci v roztoku oddělí, šetrně vysuší a ze získané sušiny se uvolní acetylcholinesteráza působením vodného roztoku 0,05 až 10 % neionogenního kondenzačního produktu lipidičkého alkoholu s etylénoxidem obecného vzorce CisH33(OC2H4)nOH, kde n je v průměru 16. Acetylcholinesterára se izoluje z tohoto roztoků ve formě rozpustného preparátu lyofilizací.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy rozpustného preparátu acetylcholinesterázy z mozkové tkáně savců.

Acetylcholinesteráza — EC 3. 1. 1. 7 — z elektrických orgánů elektrického úhoře a rejnoka, mozku a nervové tkáně savců a erytrocytů, o různé čistotě a rozpustnosti, se používá v analytice pro citlivé biochemické stanovení organofosforových a karbamátových insekticidů a dále k výzkumným účelům v neurochemii a biochemii. Použitím acetylcholinesterázy lze zvýšit citlivost stanovení reziduí organofosforových a karbamátových insekticidů v -potravinách a potravinářských surovinách a přispět k výzkumu mechanismů působení těchto látek v biochemickém materiálu.

Nedostupnost zdrojů rozpustné acetylcholinesterázy nebo její pevná vazba na buněčnou strukturu nedovolují výrobu vhodného rozpustného přípravku tohoto enzymu ve větším měřítku. Dosud známé způsoby přípravy z mozkové tkáně savců spočívají na uvolnění acetylcholinesterázy z nerozpustného lipoproteinového komplexu, ve kterém je v'mozkové tkáni vázána, a na jejím převedení do roztoku účinkem různých činidel, jako jsou některé povrchově aktivní látky, deionizované prostředí,’ hadí jedy nebo· proteolytické a Ifpolytické enzymy. Při použití povrchově aktivních látek se postupuje tak, že se mozková tkáň homogenizuje přímo v prostředí příslušné komplex štěpící povrchově aktivní látky a po odstranění buněčných struktur se acetylcholinesteráza izoluje z z roztoku srážením síranem amonným, dialízou nebo se dále přečišťuje gelovou, iontoměnnou nebo afinitní chromatografií na sloupci.

Nevýhodou všech dosud známým postupů je ,že jsou časově velmi náročné, málo efektivní z hlediska výtěžku a proto pro výrobu acetylcholinesterázy ve větším měřítku příliš nákladné a (těžko· realizovatelné.

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob přípravy rozpustného preparátu acetylcholinesterázy podle vynálezu, který je založen na štěpení nerozpustného lipoproteinového komplexu acetylcholinesterázy povrchově aktivními látkami, jehož podstata spočívá v tom, že se mozková tkáň nejprve homogenizuje při teplotě -10 až -20 °C v organickém rozpouštědle rozpouštějícím lipidy. Po 'homogenizaci se oddělí nerozpustný zbytek od roztoku a šetrně se vysuší. iTak se z mozkové tkáně odstraní volné lipidy a voda. V získané sušině je zachován nerozštěpený lipoprotelnový komplex, z něhož se uvolní acetylcholinesteráza působením vodného roztoku obsahujícího v hmotnostní koncentraci 0,05 až 10 % neionogenního kondenzačního produktu lipidického alkoholu s etylénoxidem obecného vzorce

Cl6H33(OC2H4)_nOH, kde n je v průmůru 16. Acetylcholinesterá214543 za přechází do roztoku, z něhož se izoluje ve formě rozpustného preparátu lyofilizací. Výhodným organickým rozpouštědlem rozpouštějícím lipidy je aceton, butanol, etyléter nebo jejich vzájemné kombinace.

Výhodou způsobu podle vynálezu je jeho ekonomické a jednoduché provedení, vedou-, cí k uvolnění acetylcholinesterázy z buněčné strutkury téměř se 100% výtěžkem. Získaný preparát je slabě nažloutlá, vločkovitá látka, dobře rozpustná ve vodě, o specifické aktivitě 0,16 až 0,25 U. mg.^-1. V uzavřených ampulích a za chladu ji lze skladovat neomezeně dlouho bez ztráty aktivity. Příklad 1

Z mozkové tkáně, získané z čerstvých nebo v chladíme uskladněných hovězích hlav, se pečlivě vyřízne oblast nucleus caudatus, pokud možno s nejmenším množstvím okolní tkáně.

100 g čerstvé tkáně nucleus caudatus se ve skleněné nádobě, chlazené solankou, homogenizuje po dobu 3 minut v 500 ml ace tonu při udržování teploty -15 °C. Po desetiminutovém stání se sedlina odsaje na Biichnerově nálevce a ještě vlhký koláč se znovu, krátce zhomogenizuje ve 300 ml ochlazeného acetonu. Po přefiltrování se sedlina 30 sekund homogenizuje ve 300 ml etyléteru při teplotě -15 °C, homogenát se znovu přefiltruje, zbytek na filtru se dvakrát promyje 100 ml vychlazeného etyléteru a potom se vysuší ve vakuovém exikátoru nad hydroxidem sodným;

Takto získaná acetonová sušina se homogenizuje v 750 ml 0,5% vodného roztoku neionogenní povrchově aktivní látky CIRRASOL ALN-WF po dobu, 3 minut a homogenát se potom odstředí v chlazené centrifuze při -5 °C a zrychlení 105 000 g. Čirá kapalina nad sedlinou se přenese do lyofilizačních lahví a po namrazení na stěnu se provede lyofilizace běžným způsobem. Dosušení lyofilizátu se provádí bez přihřívání. ¹

Způsobem se získá ve vodě dobře rozpustný preparát acetylcholinesterázy o specifické aktivitě 0,20 U.mg-¹. Výtěžnost preparátu je 10 %, vztaženo na hmotnost čerstvé mozkové tkáně.

Získaný technický preparát lze přímo použít jako zdroj acetylcholinesterázy pro biochemické stanovení organofosforových a karbamátových insekticidů nebo jako výchozí materiál pro získání přečištěné acetylcholinesterázy nebo pro jiné biochemické účely.

Příklad 2

100 g čerstvé tkáně nucleus caudatus se ve skleněné nádobě, chlazené solankou, homogenizuje po dobu 3 minut v 500 ml butanolu o teplotě -20 °C. Po desetiminutovém stání se nerozpustný zbytek odsaje a znovu krátce homogenizuje ve vychlazeném butanolu. Dále se pokračuje obdobně, jak uvedeno v příkladu 1.

Claims

Předmět

1.. Způsob přípravy rozpustného preparátu acetylcholinesterázy z mozkové tkáně, založený na štěpení nerozpustného lipoproteinového komplexu acetylcholinesterázy povrchově aktivními látkami, vyznačující se tím, že se mozková tkáň homogenlzuje při tepjotě -10 až -20 °G v .organickém rozpouštědle rozpouštějícím lipidy, poté se nerozpustný zbytek, zůstávající po homogenizaci y roztoku oddělí, šetrně vysuší, načež se ze získané sušiny působením vodného roztoku obsahujícího v hmotnostní koncentraci 0,05 až 10 °/o neionogenního kondenzačního provynálezu duktu lipidického alkoholu s etylénoxidem obecného vzorce

CieH33(OC2H4)_nOH,

- kde n je v průměru 16, uvolní acetylcholinesteráža přecházející do tohoto roztoku, z něhož se izoluje ve formě rozpustného preparátu lyofillzací.
2. Způsob přípravy rozpustného preparátu podle bodu 1, vyznačující se tím, že organickým rozpouštědlem rozpouštějícím lipidy je aceton, butanol, etyléter nebo jejich libovolná kombinace.