CS214543B1

CS214543B1 - Process for preparing a soluble preparation of acetylcholinesterase

Info

Publication number: CS214543B1
Application number: CS39781A
Authority: CS
Inventors: Josef Zabransky; Jirina Marhoulova
Original assignee: Josef Zabransky; Jirina Marhoulova
Priority date: 1981-01-20
Filing date: 1981-01-20
Publication date: 1982-04-09

Abstract

Mozková tkáň se homogenizuje při teplotě -10 až -20 °C v organickém rozpouštědle rozpouštějícím lipidy, poté se nerozpustný zbytek zůstávající po homogenizaci v roztoku oddělí, šetrně vysuší a ze získané sušiny se uvolní acetylcholinesteráza působením vodného roztoku 0,05 až 10 % neionogenního kondenzačního produktu lipidičkého alkoholu s etylénoxidem obecného vzorce CisH33(OC2H4)nOH, kde n je v průměru 16. Acetylcholinesterára se izoluje z tohoto roztoků ve formě rozpustného preparátu lyofilizací.Brain tissue is homogenized at a temperature of -10 to -20 °C in an organic solvent that dissolves lipids, then the insoluble residue remaining in the solution after homogenization is separated, gently dried, and acetylcholinesterase is released from the obtained dry matter by the action of an aqueous solution of 0.05 to 10% of a nonionic condensation product of a lipid alcohol with ethylene oxide of the general formula CisH33(OC2H4)nOH, where n is on average 16. Acetylcholinesterase is isolated from this solution in the form of a soluble preparation by lyophilization.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy rozpustného preparátu acetylcholinesterázy z mozkové tkáně savců.The invention relates to a process for the preparation of a soluble acetylcholinesterase preparation from mammalian brain tissue.

Acetylcholinesteráza — EC 3. 1. 1. 7 — z elektrických orgánů elektrického úhoře a rejnoka, mozku a nervové tkáně savců a erytrocytů, o různé čistotě a rozpustnosti, se používá v analytice pro citlivé biochemické stanovení organofosforových a karbamátových insekticidů a dále k výzkumným účelům v neurochemii a biochemii. Použitím acetylcholinesterázy lze zvýšit citlivost stanovení reziduí organofosforových a karbamátových insekticidů v -potravinách a potravinářských surovinách a přispět k výzkumu mechanismů působení těchto látek v biochemickém materiálu.Acetylcholinesterase - EC 3. 1. 1. 7 - from electric organs of electric eel and rays, brain and nerve tissue of mammals and erythrocytes, of different purity and solubility, is used in analytics for sensitive biochemical determination of organophosphorus and carbamate insecticides and for research purposes in neurochemistry and biochemistry. The use of acetylcholinesterase can increase the sensitivity of the determination of organophosphorus and carbamate insecticide residues in food and food raw materials and contribute to research into the mechanisms of action of these substances in biochemical material.

Nedostupnost zdrojů rozpustné acetylcholinesterázy nebo její pevná vazba na buněčnou strukturu nedovolují výrobu vhodného rozpustného přípravku tohoto enzymu ve větším měřítku. Dosud známé způsoby přípravy z mozkové tkáně savců spočívají na uvolnění acetylcholinesterázy z nerozpustného lipoproteinového komplexu, ve kterém je v'mozkové tkáni vázána, a na jejím převedení do roztoku účinkem různých činidel, jako jsou některé povrchově aktivní látky, deionizované prostředí,’ hadí jedy nebo· proteolytické a Ifpolytické enzymy. Při použití povrchově aktivních látek se postupuje tak, že se mozková tkáň homogenizuje přímo v prostředí příslušné komplex štěpící povrchově aktivní látky a po odstranění buněčných struktur se acetylcholinesteráza izoluje z z roztoku srážením síranem amonným, dialízou nebo se dále přečišťuje gelovou, iontoměnnou nebo afinitní chromatografií na sloupci.The unavailability of sources of soluble acetylcholinesterase or its solid binding to the cell structure does not allow the production of a suitable soluble preparation of this enzyme on a larger scale. Previously known methods from mammalian brain tissue are based on the release of acetylcholinesterase from the insoluble lipoprotein complex in which it is bound in the brain tissue and its dissolution by the action of various agents such as certain surfactants, deionized environments, snake venoms or · Proteolytic and Ifpolytic enzymes. When surfactants are used, the brain tissue is homogenized directly in the environment of the respective complex of the cleavage surfactant and, after removal of cell structures, acetylcholinesterase is isolated from the solution by ammonium sulfate precipitation, dialysis or further purified by gel, ion exchange or affinity column chromatography .

Nevýhodou všech dosud známým postupů je ,že jsou časově velmi náročné, málo efektivní z hlediska výtěžku a proto pro výrobu acetylcholinesterázy ve větším měřítku příliš nákladné a (těžko· realizovatelné.The disadvantage of all the prior art processes is that they are very time-consuming, inefficient in yield, and therefore too expensive and (hardly feasible) to produce large scale acetylcholinesterase.

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob přípravy rozpustného preparátu acetylcholinesterázy podle vynálezu, který je založen na štěpení nerozpustného lipoproteinového komplexu acetylcholinesterázy povrchově aktivními látkami, jehož podstata spočívá v tom, že se mozková tkáň nejprve homogenizuje při teplotě -10 až -20 °C v organickém rozpouštědle rozpouštějícím lipidy. Po 'homogenizaci se oddělí nerozpustný zbytek od roztoku a šetrně se vysuší. iTak se z mozkové tkáně odstraní volné lipidy a voda. V získané sušině je zachován nerozštěpený lipoprotelnový komplex, z něhož se uvolní acetylcholinesteráza působením vodného roztoku obsahujícího v hmotnostní koncentraci 0,05 až 10 % neionogenního kondenzačního produktu lipidického alkoholu s etylénoxidem obecného vzorceThe above-mentioned disadvantages are overcome by the process for the preparation of the soluble acetylcholinesterase preparation according to the invention, which is based on the cleavage of the insoluble lipoprotein complex of acetylcholinesterase by surfactants, characterized in that the brain tissue is first homogenized at -10 to -20 ° C in an organic solvent . After homogenization, the insoluble residue is separated from the solution and dried gently. Thus, free lipids and water are removed from brain tissue. The non-cleaved lipoprotein complex from which the acetylcholinesterase is released by treatment with an aqueous solution containing 0.05-10% by weight of the nonionic condensation product of the lipid alcohol with the ethylene oxide of the general formula is retained in the dry matter obtained.

Cl6H33(OC2H4)_nOH, kde n je v průmůru 16. Acetylcholinesterá214543 za přechází do roztoku, z něhož se izoluje ve formě rozpustného preparátu lyofilizací. Výhodným organickým rozpouštědlem rozpouštějícím lipidy je aceton, butanol, etyléter nebo jejich vzájemné kombinace.C 16 H 33 (OC 2 H 4) _n OH, where n is on the average 16. Acetylcholinester 214543 is transferred to a solution from which it is isolated as a soluble preparation by lyophilization. A preferred organic lipid dissolving solvent is acetone, butanol, ethyl ether, or combinations thereof.

Výhodou způsobu podle vynálezu je jeho ekonomické a jednoduché provedení, vedou-, cí k uvolnění acetylcholinesterázy z buněčné strutkury téměř se 100% výtěžkem. Získaný preparát je slabě nažloutlá, vločkovitá látka, dobře rozpustná ve vodě, o specifické aktivitě 0,16 až 0,25 U. mg.^-1. V uzavřených ampulích a za chladu ji lze skladovat neomezeně dlouho bez ztráty aktivity. Příklad 1An advantage of the process according to the invention is its economical and simple execution, leading to the release of acetylcholinesterase from the cellulum in almost 100% yield. The preparation obtained is a slightly yellowish, flocculent substance, soluble in water, with a specific activity of 0.16 to 0.25 U. mg. ^-1 . In closed ampoules and refrigerated, it can be stored indefinitely without losing activity. Example 1

Z mozkové tkáně, získané z čerstvých nebo v chladíme uskladněných hovězích hlav, se pečlivě vyřízne oblast nucleus caudatus, pokud možno s nejmenším množstvím okolní tkáně.Nucleus caudatus is carefully excised from brain tissue obtained from fresh or cold stored bovine heads, with as little surrounding tissue as possible.

100 g čerstvé tkáně nucleus caudatus se ve skleněné nádobě, chlazené solankou, homogenizuje po dobu 3 minut v 500 ml ace tonu při udržování teploty -15 °C. Po desetiminutovém stání se sedlina odsaje na Biichnerově nálevce a ještě vlhký koláč se znovu, krátce zhomogenizuje ve 300 ml ochlazeného acetonu. Po přefiltrování se sedlina 30 sekund homogenizuje ve 300 ml etyléteru při teplotě -15 °C, homogenát se znovu přefiltruje, zbytek na filtru se dvakrát promyje 100 ml vychlazeného etyléteru a potom se vysuší ve vakuovém exikátoru nad hydroxidem sodným;100 g fresh tissue of nucleus caudatus is homogenized for 3 minutes in 500 ml ace of tone in a glass vessel cooled with brine, maintaining the temperature at -15 ° C. After standing for 10 minutes, the grounds are sucked off on a Biichner funnel and the wet cake is again homogenized briefly in 300 ml of cooled acetone. After filtration, the sediment is homogenized in 300 ml of ethyl ether at -15 ° C for 30 seconds, the homogenate is again filtered, the filter residue is washed twice with 100 ml of cold ethyl ether and then dried in a vacuum desiccator over sodium hydroxide;

Takto získaná acetonová sušina se homogenizuje v 750 ml 0,5% vodného roztoku neionogenní povrchově aktivní látky CIRRASOL ALN-WF po dobu, 3 minut a homogenát se potom odstředí v chlazené centrifuze při -5 °C a zrychlení 105 000 g. Čirá kapalina nad sedlinou se přenese do lyofilizačních lahví a po namrazení na stěnu se provede lyofilizace běžným způsobem. Dosušení lyofilizátu se provádí bez přihřívání. ¹ The acetone solid thus obtained is homogenized in 750 ml of a 0.5% aqueous solution of the non-ionic CIRRASOL ALN-WF surfactant for 3 minutes and the homogenate is then centrifuged in a refrigerated centrifuge at -5 ° C and an acceleration of 105,000 g. transfer to the lyophilization bottles and after freeze-thawing, freeze-drying in a conventional manner. Drying of the lyophilisate is carried out without reheating. ¹

Způsobem se získá ve vodě dobře rozpustný preparát acetylcholinesterázy o specifické aktivitě 0,20 U.mg-¹. Výtěžnost preparátu je 10 %, vztaženo na hmotnost čerstvé mozkové tkáně.In this way, a water-soluble preparation of acetylcholinesterase having a specific activity of 0.20 U.mg- ^{1 is obtained} . The recovery of the preparation is 10% based on the weight of fresh brain tissue.

Získaný technický preparát lze přímo použít jako zdroj acetylcholinesterázy pro biochemické stanovení organofosforových a karbamátových insekticidů nebo jako výchozí materiál pro získání přečištěné acetylcholinesterázy nebo pro jiné biochemické účely.The obtained technical preparation can be directly used as a source of acetylcholinesterase for biochemical determination of organophosphorus and carbamate insecticides or as a starting material for obtaining purified acetylcholinesterase or for other biochemical purposes.

Příklad 2Example 2

100 g čerstvé tkáně nucleus caudatus se ve skleněné nádobě, chlazené solankou, homogenizuje po dobu 3 minut v 500 ml butanolu o teplotě -20 °C. Po desetiminutovém stání se nerozpustný zbytek odsaje a znovu krátce homogenizuje ve vychlazeném butanolu. Dále se pokračuje obdobně, jak uvedeno v příkladu 1.100 g of fresh nucleus caudatus tissue is homogenized in 500 ml of -20 ° C butanol for 3 minutes in a glass vessel cooled with brine. After standing for 10 minutes, the insoluble residue is filtered off with suction and again homogenized briefly in cold butanol. The procedure is continued analogously to Example 1.

Claims

Subject

Process for the preparation of a soluble acetylcholinesterase preparation from brain tissue, based on the cleavage of the insoluble lipoprotein complex of acetylcholinesterase by surfactants, characterized in that the brain tissue is homogenized at -10 to -20 ° C in an organic lipid-dissolving solvent, then the insoluble residue remaining after homogenization of the solution is gently dried and is then dried from the obtained dry matter by treatment with an aqueous solution containing, in a concentration of 0.05 to 10% by weight, of the non-ionic condensation of the duct of lipid alcohol with ethylene oxide of the formula

CieH33 (OC2H4) _n OH,

- where n is on average 16, it liberates acetylcholinesterase into this solution, from which it is isolated in the form of a soluble preparation by freeze-drying.

2. A process according to claim 1 wherein the organic lipid-dissolving solvent is acetone, butanol, ethyl ether, or any combination thereof.