CS211215B1 - Sposob kvantitativnej izolácie bielkovín z polyakrylamidových gélov - Google Patents

Abstract

Vynález sa týká spčsobu kvantitatívnej izolácie bielkovín z polyakrylamidových gélov. Podstata vynálezu spočívá v tom, že před vykonáním elektroforézy sa na gelový rez uložený na polyakrylamidovom nosiči přidá pufrovací roztok o pH 8,5 až 9,5 a koncentrácii 0,02 až 0,2 mól/liter v množstve minimálně rovnom objemu gólového řezu, výhodné tris/hydroxymethyl/aminometán s prídavkom glycerolu, nad ktorý sa ■ navrství roztok anorganickej soli o koncentrácii 1 až 2 mól/liter v množstve minimálně rovnom objemu gólového řezu. MVýznam vynálezu spočívá v tom, že umožňuje rýehlu, rutinnú, technicky nenáročná kvantitatívnu elúciu bielkovin z gólových rezov, v štandardných elektroforetických aparatúrach. Vynález má uplatnenie t v aplikovanomzvýskume, biochémii, imunologii a hematologii.

Description

Vynález sa týká spdsobu kvantitativnéj izolácie bielkovin z polyakrylamidových gélov.

Po detekcii biélkoviny na polyakrylamidovom góle sa doteraz bielkovina izolovala bud chemickým spčsobom (depolymerizácia pomocu peroxidu vodíka) alebo elektroforézou s opačnou polaritou. Pri chemickom spčsobe izolácie sa vo vzorke vyskytuje značné množstvo depolymerizovaného materiálu z nosiča (gélu). Pri elektroforéze s opačnou polaritou bolo potřebné použiť špeciálne konstruované trubičky, alebo modifikované elektroforetické zariadenie, ktoré použivajú na zachytenie biélkoviny napr. dialyzačné membrány, alebo hydroxylapatit. Použitie týchto metod izolácie je spojené s náročnou manipuláciou a zložitou přípravou jednotlivých trubičiek obsahujúcich gélové řezy. Použitie dialyzačných membrán a hydroxylapatitu vedie k nespecifickéj absorpci bielkovin na týchto materiáloch, čo spSsopuje nekvantitatívnu izoláciu bielkovin. Okrem toho sa bielkovina vo váčšine metod zachytává v značnou: objeme, čo zvyčajne vyžaduje ďalší krok, spočívajúci v koncentrácii biélkoviny. Aplikácia spomenutých špeciálnych trubičiek zabraňuje rutinnému spracovaniu vzoriek.

Tieto nevýhody sú odstraněné spčsobom podTa vynálezu, ktorého podstata spočívá v tom, že před elektroforézou sa na gélový rez uložený na polyakrylamidovom nosiči přidá pufrovací roztok o pH 8,5 až 9,5 a koncentrácii 0,02 až 0,2 mól/liter v množstve minimálně rovnom objemu gélového řezu, výhodné tris/hydroxymetyl/aminometán s prídavkom glycerolu, nad ktorý sa navrství roztok anorganickej soli o koncentrácii 1 až 2 mól/liter v množstve minimálně rovnom objemu gélového řezu.

Vzostupný diskontinuálny gradient vodivosti nachádzajúci sa nad gélovým rezom zabráni úniku biélkoviny do elektroforetického média a zostupný gradient hustoty, nachádzajúci sa nad gélovým rezom udržuje vzestupný gradient vodivosti.

Vynález umožňuje rýchlu, rutinnú, techniky nenáročná kvantitatívnu elúciu bielkovin z gólových rezov v štandardných elektroforetických aparatúrach. Eluovaná kvapalina sa zachytává v malom objeme - menej ako 0,2 ml.

Příklad

Postup je vysvětlovaný v súvislosti s připojeným výkresom.

Gélový rez obsahujúci príslušnú bielkovinu, napr. myoglobín, hovadzí sérum albumin alebo inzulín (úsek B), sa uloží do bežnej trubičky, ktorá je naplněná do 3/4 svojho objemu polyakrylamidovým gélom, napr. polymerizát z 10 % akrylamidu (úsek A). Nad gélový rez sa napipetuje roztok o nízkej vodivosti, napr. 0.15 ml 0,025 M tris/hydroxymethyl/aminometánu, 0,075 M glyoínu, 30 % objemových glycerolu (pH = 8,8) (úsek C). Nad úsek C sa opatrné pipetuje roztok 2 ?.» chloridu sodného (úsek D) o vysokej vodivosti a nižšej hustoty oproti roztoku v úseku C až do horného okraja trubičky. Prevedie sa elektroforéza s opačnou polaritou po dobu 1 až 3 hodiny (1 hodina za nepřítomnosti dodecylsulfátu sodného). Aplikuje sa prúd 4 mA na jednu trubičku. DÍžka elúcie je závislá od druhu izolovanej bielkoviny, hrůbky gélového řezu a přítomnosti dodecylsulfátu sodného. Eluovaná bielkovina sa nachádza v malom objeme v úseku C. Výťažok pri testovaných bielkovinách bol priemerne napr. při myoglobíne 95 %. V případe použitia gólových rezov, ktorých hustota je nižšia ako hustota roztoku v úseku C sa može hustota řezu zvýšit inkubáoiou tohoto řezu v riedenom roztoku izopropylalkoholu.

Vynález má uplatnenie na kvantitatívnu elúciu bielkovin z gólových rezov v aplikovanom výskume, v biochémii, v imunologii a hematologii.

Claims (2)

1. SpSsob kvantitativné;) izolácie bielkovín z polyakrylamidových gélov elektroforézou s opačnou polaritou, vyznačujúci sa tým, že před elektroforézou sa na gélový rez uložený na polyakrylamidovom nosiči přidá pufrovací roztok o pH 8,5 až 9,5 a koncentrácíi 0,02 až 0,2 mól/liter v množstve minimálně rovnom objemu gólového řezu, výhodné tris/hydroxymetyl/aminometán s prídavkom glycerolu, nad ktorý sa navrství roztok anorganickej soli o koncentrácíi 1 až 2 mól/liter v množstve minimálně rovnom objemu gólového řezu.