CS211190B1 - Kmeň virusu Aujeszkyho choroby avirulentný pre ošipané a sposob jeho šťachtenia - Google Patents

Description

1 211190

Vynález sa týká kmeňa Aujeszkyho choroby /ďalej Au. ch./ avirulentného pre ošípanéschopného priemyselnej multíplíkácie na buňkových kulturách pěstovaných in vitro pre pří-pravu žívej očkovacej látky., s,p$3£hu. jeh$ izQlác-le. a .p,Q,uňiti,A· pra. imunizáci.u ošipaných.

Au. ch. sa stala v poslednom desaťročí jednou z najvýznamnéjsích nákaz ošípaných víru-sovej povahy. Je tomu tak preto, že sa doposiaí nepodařilo vyporiadať sa s Au. ch, ani v jed-nom z dávnejšie zamořených štátov, ba naopak, objavujesa v státoch v kterých bola donedávnaneznámou a v niektorých štátoch so sporadickým výskytom došlo k posledných rokoch k jej epi-zootickému rozšíreniu /Herrick J. B: Highlights of the Pseudorabies Fact-Finding Conference,Vet.-Med. Smáli Anim. Clin. , 1 360-1 362 , 1 977, Torna B.., Goret P.: La maladie ďAujeszky enFrance, Can. Méd. Vét., 43, 225-236, 1974/. Zlyhanie uplatňovaných protinákazových opatřenía vysoké hospodářské škody ktoré Au. ch. v podmienkach velkochovov zapříčiňuje, si vyzíadalizavedenie špecifíckej profylaxie. Až donedávna neúspěšné výsledky všetkých pokusov o přípravu úcín.nej inaktivovanej vakcí-ny /Wittman G.: Die Šchutzimpfuňg gegen Aujeszkysche Krenkheit /AK/ mít inaktivierten VakzinenDtsch. Tierárztl. Wschr. Š6, 316-322, 1979/ viědli k tomu, že sa hlavná pozornost zameralana výskům a používanie živých vakcín. Živé vakcíny připravené z kmeňov atenuovaných na zvie-ratách /Toneva V.: Variabilitě du virus de la maladie d“Aujeszky. Vaccin contre la maladieďAujeszky. Vaccin contre la maladie d-Aujeszky obtenu de souche du virus Aujeszky atténuéa l'aide de passages par der pigeons, Vet.-Med. Nauki, I. 35--42, 1964/ bolí příliš virulentněa preto pre přípravu živých vakcín nevhodné. Ani živé vakcíny připravené z kmeňov atenuova-ných sériovými pasážami na kuřácích zárodkoch /Bran L., Suhaci I., Ursache R.: Imminizingvalue of the egg-adapted pseudorabies virus strain Bucarest after a various number of chickembryo passages, Archiva Teter., 5., 75-81 , 1968, Bazylev P. M. , Prochorova E, M,: Suchajavirusvakcina protiv bolezni Aujeszki iz stamma GNKI, Veterinarija, č. 2, 44-45, 1970, nezodpo-vedali vedecky předloženým požiadavkám pre přípravu živých vakcín.

Moderně živé vakcíny majú představovat homológne populácie virusu nepěstovaného z gene-ticky stabilných klónov derivovaných z virusových kmeňov plakovou technikou. Bartha /BarthaA.: Experimental reduction of virulence of Aujeszky""s dísease virus, Mágy. Állatorv. Lap., 16, 42-45, 1961/ odštiepil z virulentného kmeňa sériovo pasážovaného na prasačích obláčko-vých kulturách maloplakový klon ”K", ktorý slúži pre přípravu žívej vakcíny v mCr /BarthaA.: Le vaccin hongroic contre la maladie d-Aujeszky, Cah. Méd. Vét., 43, 338--340, 1974/. Žuffa izoloval z kmeňa Bukurešt, sériovo pasážovaného na kultúrach kuřácích embryonálnychbuniek štyri linie vykazujúce rozdielny stupeň reziduálnej virulencie pre laboratorně ahospodářské zvieratá. Línia s označením Buk-TK-300/9,2 slúži k príprave vakcíny NORVAK 1/Žuffa A.: Imunizácia proti Aujeszkého chorobě - Xzolovanie klonu avirulentného pre králíkya morčatá a hodnotenie jeho imunogenity, Vet.-Med. /Praha/ 1 6, 525-538. 1971, Žuffa A.: SalajJ.: Imunizácia proti Aujeszkého chorobě. Imunogenita avirulentného klonu Buk-TK-900/6.K kpríprave žívej vakcíny NORVAK 2 /Žuffa A.: Salaj I.: Imunizácia proti Aujeszkého chorobě -imunogenita vysokoatenuovaného kmeňa Buk-TK-900/IV, a pre ošípané, Vet.-Med. /Praha/16,221-223, 1971/, ktoré sa používajú k imunizácii kožušinových zvierat, oviec a hovádzieho do- bytka.

Pre přípravu živých vakcín SUIVAK 1 a SUIVAK 2 určených pre očkovanie ošípaných slúžíalinie Buk-TK-900/IV, a /Žuffa A., Salaj J.: Imunizácia potí Aujeszkého chorobě - imunogenitavysokoatenuovaného kmeňa Buk-TK-900/IV, a pře ošípané. Vet.-Med. /Praha/ 1 6 , 221-233, 1971/resp. Buk-TK-200/3.PPM /Žuffa A.: Immunisierung gegen die Aujeszkysche Krankheit, I. Gewinnungdes modifizierten Virus der Aujeszkyschen Krankheit, Arch. exp. vet.-Med., 17, 1 325-1 344,1963/. Z kmeňa Bukurešt derivovali Skoda a kol. linie /Skoda R., Brauner I., Sádecký E.,

Maxer V.: Iramunization against Aujeszký s disease with live vaccine I. Attenuation of virusand some propertíes of attenuated strains. Acta virol., 1-9, 1964/ na úrovni 336, a 621. pasáže na kuřácích fibrob lastoch a použili ich k príprave pokusných živých vakcín: pre nežia-ducí stupeň reziduálnej virulencie, ktorý si zachovali aj po překonaní 1 000 tkaninových pasa- 211190 2 ží /Jamrichová 0., Skoda R.: Multiplicatíon and dístributíon of attenuated pseudorabies virusin the organism of vaccinater pigs. Acta virol., 13, 42-51 , 19697se však pre komerčnú výrobu nepoužili. Vírusovú líniu avirulentnú pre hovádzí dobytok izolovali Svobodová a kol. /Svobodová J.,Sabo A., BlaŠkovič D.: Immunogenicity of an attenuated pseudorabies virus in cattle, Acta vi-rol., 1 4, 263, 1970/ z atenuovanébo kmeňa Buk-621 cestou dlhodobej perzistentnej infekciekultur z telacích obličiek, ktorého imunogenita sa kontrolovala len na králikoch a dobytku.Analogicky ako Žuffa pri selekcii linie Buk-TK-300/9,2 postupoval aj Torna /Torna B.: Study ofa temperature sensitive strain of Aujeszky virus, Proč. 5th vorls 9.P.V.S. Congresa, Zagreb,1978/ a z virusu dlhodobe pasážovaného na kultúrach kuřácích embryonálnych buniek izolovaltermosenzitívny kmen Alfort, a použil ho pre pripravu žívej vakcíny. Konečne Tatarov /Tata-rov G.: Apathogener Mutant des Aujeszky-Virus, induzieert von 5-Jodo-2-Deoxyuridin /JUDR7,Zbl. Vet.-Met., B, 1 5, 847-853, 1968/ izoloval avirulentnú mutantu MK z virusu pomnožovaného na kultúrach z kuřácích zárodkov selekciou plakov rezistentných proti 5~jodo-deoxyuridinu,

Pri štúdiu neškodnosti a imunizačnej účinnosti jednotlivých avirulentných a a-tenuova-ných kmeňov virusu Au. ch. používaných pre pripravu živých vakcín sa zistilo, že sú medzinimi významné rozdiely. Kmen Buk-TK-900/IV, a je avirulentný pre všetky věkové katego-rie ošípaných pri lubovolnom spósobe aplikácie, ale súčasne neschopný množit sa v organizmeočkovaných zvierat a preto požadovanú imunitnú odpověď u ošípaných vyvolá len pri aplikáciivelkej dávky virusu; přítomnost protilátok kolostrálneho povodu interferuje pri očkovaní ci-cajúcich prasiat a odstavČiat s vývojom aktívnej imunity. Očkovanie prasnic stimuluje tvorbuprotilátok len do nízkých až středných titrov, a preto obsah protilátok v kolóstre neposkytu-je ciciakom spolahlivú ochranu proti ochoreniu /Žuffa A., Grunert Z.: Les· vaccins utilisésen Tchécoslovaquie contre la maladie ďAujeszky, Csh, Méd. Vét., 43, 334-337, 1974/. Inter-ferující účinok koloetrálnych protilátok s vývojom aktívnej imunity si pri očkovaní prasiattýmto vírusom vyžaduje pre dosiahnutie spolahlivej ochrany dvojrázové očkovanie pričom druhésa musí uskutečnit až po vylúčení materinských protilátok.

Kmen ’’K” je virulentný pre prasačie plody počas celého intrauterínneho vývoja /Sokol A.,Gallo T.: Dístributíon of Bartha-s vaccin strain of Aujeszky"s disease virus in pig foetusesafter intraperitoneal application, Folia microbiol., 16, 544, 1971/ a preto jeho použitiepre imunizovanie gravidných prasnic je spojené s určitým rizikom. Naviac iraunitná odp(oveďpo jednorázovora očkovaní je nedostatočná, a preto sa vyžaduje dvojrázové očkovanie odstav-Čiat v intervale 3 až 4 týždňov a prasnic vždy v poslednom trimestri gravidity /Bartha A.:

Le vaccin hongrois contre la maladie d-Aujeszky, Cah. Méd. Vét., 43, 338-340, 1974/.

Rovnako sa postupuje aj pri iraunizácii ošípaných pomocou živých vakcín připravenýchz kmeňov MK /Tatarov G., Boyadjiew St., Wesselinova A., Gergow P.: Untersuchung der Pathoge-nese der Aujeszkyschen Krankheit, Tagung zur ”Probleme und Prophylaxe der industriemassigenSchweineproduktion”, Vratze, Bulgarion, 14, 1975/ a termorezistentného kmeňa Alfort /TornaB., Brun A., Chappuis G., Terre J.: Propoiétés biologiques d”une souche thermosensible/Alfort· 26/ de virus de la maladia ďAujeszky, Res. Méd. Vét., 1555, 245-252, 1 979/. KmeneBuk-TK-200/3. PPM /Žuffa A.: Immunisierung gegen die Aujeszkyschen Krankheit. I. Gewinnungdes modifizierten Virus der Aujeszkyschen Krankheit, Arch. exp. Vet.-Med., 17, 1 325-1 344,1963/ a Buk-621 /Skoda R., Brauner I., Sádecký E., Mayer V.: Immunization against Aujeszky’sdisease with live vaccine I. Attenuation of virus and some properties of attenuated strains,Acta virol., 8, 1-9, 1964/ sú imunogénne pre ošípané aj pri aplikácii malých dávok, ale poinjekčnom podaní sa množia nielen v tkanivách miesta vpichu a prilahlých lymfatických uzli-nách ale prenikajú příležitostné aj do krvi, ústredného nervstva, mandlí a slizníc hornýchdýchacích ciest, čo je spojené s nebezpečím vyluČovania virusu sekrétami do vonkajšieho pro-strediá a přenosu na spoluustajnené vnímavé ošípané./Žuffa A.:. Immunisierung gegen die Auje-szkysche Krankheit. I. Gewinnung des modifizierten Virus der Aujeszkyschen Krankheit, Arch.exp. Vet.-Med., 1 7, 325-1 344, 1963/. Pre nedostatočný stupeň atenuovania virulencie sú tieto kmene z epizootologického hladiska pre pripravu živých vakcín proti Au. ch. nevhodné. 3 211190

Napriek tomu, že v posledných rokoch bolí vyvinuté účinné inaktivované vakcíny protiAu. ch. /Wittmann G.: Die Schutzimpfung gegen Aujeszkysche Krankheit /AK/ mit inaktiviertenVakzinen, Dtsch. tierarztl. Wschr., 86 , 316-322, 1979/ ostává imunoproxylaxia tejto nákazy v oblastiach s enzootickým připadne epizootickým výskytom metodou volby použitím živých vakcín/Žuffa A., Salaj J.: Resistence of pigs Immunized with live or inactivated Aujeszky"s diseasevaccines against experimental infection, IPVS Congress, Copenhagen, Denmark, 1980. In Pres7.

Aj keď sa inaktívovaným vakcínam pripisujú očité epizooto1ogické přednosti, nie sú efektívnej-šie ani pri zničovaní hospodářských strát, ani pri eliminovaní virulentného virusu zo zamo-řených chovov /Skoda R.: The control of Aujeszky-s disease in Karge swine units by use ofattenuated live vaccines, IPVS Congres, Ames Iowa, USA, 1976, G6/.

Prihliadajúc k technickej náročnosti, nákladom spojeným s očkováním ale aj vývojom lo-kálnych a celkových reakcií spojených s používáním inaktivovaných vakcín /Wittnamnn G.:

Die Schutzimpfung gegen Aujeszkysche Krankheit /&.YJ mit inaktivierten Vakzinen, Dtsch. tie-rárztl. Wschr., 8 6, 3 1 6-322 , 1 979/ je pri endemickom zamoření chovov oš.ípaných Aujeszkyho ví- rusom výhodnejšie robit imunoprofylaxiu pomocou neškodných účinných živých vakcín.

Uvedené nedostatky spojené s kvalitou živých očkovacích látok proti Au. ch. sú riešenépodlá vynálezu, ktorého podstata spočívá vo vyšlachtení avirulentného ímunogénneho virusovéhoklonu cestou dlhodobého pasážovania kmeňa BukureŠť na primárných kultúrach z kuřácích zárod-kov pri teplote 36 °C až 38 °C - 150 až 250 sériových pasáží -, následnej selekcii linie,metodou hraníčných riedení alebo plakovou technikou so šesťnásobným opakováním, ktorá saďalej pasážuje na rovnakom druhu tkaniva pri postupnom zničovaní kultivačnej teploty o1 °C na hodnotu 30 °C až 33 °C a pri tejto teplote pasážuje 20 až AOkrát, adaptovaní získa-ného virusu na rast na fetalne bovínne oblickové kultury a selekcii virusového klonu plakovoutechnikou na kuřácích embryonálnych buňkách so šestnásobným opakováním.

Vyšlachtení vakcinačný kmen vykazuje výhodné rastové vlastnosti na bukových kultúrachpřipravených známým sposobom z kuřácích zárodkov alebo kačacích zárodkov, s obsahom 10?až 10 ΤΚΙΟ^θ vírusu/ml v infekčných tekutinách z uvedených tkaniv. Je neškodný pre ošípanékaždého veku pri parenterálnej, i. nas. alebo inhalačnej aplikácii, nepoškodzujú vyvíjajúcesa plody pri očkovaní prasnic v lubovolnom stádiu gravidity, vyvolává imunitnú odpověď ucicajúcich prasiat aj za přítomnosti nízkých a středných titrov materinských protilátok, vy-volává vysoký stupeň ochrany proti ochoreniu pri prirodzenej a experimentálněj infekcii pojednorázovej aplikacii aj poměrně malej dávky virusu, a očkováním prasnic v zamořených cho-voch vyvolá spolahlivú ochranu cicajúcich prasiat proti klinickému ochoreniu protilátkamipřijatými kolostrom; po parenterálnej aplikácii sa virus z očkovaných ošípaných nevylučujea nešíri kontaktom na spoluustájnené vnímavé ošípané.

Imunobiologické vlastnosti vyšlachteného kmeňa dovolujú připravit 2 něho živú vakcínu,aplikáciou ktorej sa dosiahne v endemicky zamořených chovoch ochrana celej populácie ošípa-ných proti klinickému ochoreniu za použitia najjednoduchšej imunizačnej schémy aká sa dopo-sial pri imunoprofy1axii Au. ch. použila.

Kmeň Buk-TK/650 uložený v zbierke mikroorganizmov na Výskumnom ústave veterinárněholekárstva v Brně Medlánkach, Hudcova 60 pod číslom CAMP V-265 bol izolovaný sposobom podlá vy-nálezu z virulentného kmeňa Bukurešt zo zbierky Pasteurovho ústavu v Bukurešti, kde sa na-chádza pod označením Bucarest /Bran L., Suthaci I., Ursache R. : Immunizing value of theegg-adapted pseudorabies virus strain Bucarest after a varicus number of chick embryo passa-ges, Archiva Teter., _5, 75-81, 1968/ tak, že sa tento prepasážoval 200krát na primárných kul- túrach z kuřácích zárodkov. Virus v 200. tkanivovej pasáži bol postupným znižovaním kultivač-nej. teploty a tým selekciou virusových Častíc s dobrými multiplikačnými vlastnosťami prinízkých teplotách, adaptovaný na rast pri teplote 30 až 33 °C s výhodou pri 32 °C. V tejtofáze selekčného procesu sa na úrovni 30. sériovej pasáže pri 32 °C metodou hraničných riešeníso šestnásobným opakováním na skúmavkových kultúrach z kuřácích embryí prostých specificky pa-Logénnych zárodkov /SPF/ izolovala línía, ktorá bola testovaná na . štvortýžďnových prasatách 211190 4 prostých protilatok proti Aujeszkého virusu so zřetelem na rezíduálny stupen virulencie a ímunogénne schopností.

Reziduálna virulencia tejto linie bola cfalej atenuovaná pasážovaním na buňkových kultů*·rach z fetálnych obličiek. Postupovalo sa přitom následovně: Skúmavkové kultury fetálnych bo-vínnych obličiek v prvej subpasáži sa infikovali za 24 hod. od naloženia, t. j. před vytvoře-ním súvislého monolayera po zliatí rastového média dávkou 0,2 ml neriedeného virusu, virusnechal adsorbovat 1 hod. pri 37 °C a kultury zaliali 1 ml Earlovho média s 2 % fétalnehobovinneho séra. Infikované kultury sa ínkubovali pri 37 °C počas 3 až 4 dní v období takmerúplného vírusšpecifického rozpadu tkaniva. Rovnako sa postupovalo aj pri dalších pasážachvirusu na. fetálnych bovínnych oblickových kulturách s inkubovaním počas 3 až 5 dní, príčomvývoj cytopatických zmien postupné klesal až v 5. priamej pasáži na uvedenom druhu tkanivasa přítomnost vírusovej infekcie prejavovala len nevýrazným poškodením tkaniva charakterizo-vaným okruhlobunečnou degeneráciou ojedinělých buniek. V tomto stádiu sa virus pomnožil nakulturách kuřácích embryonálnych buniek, na ktorých vyvolal úplné lýzu tkaniva s vysokým obsa-hom infekČného virusu v tkaninových tekutinách.

Takto pomnožený virus sa použil pre pasážovanie na kultúrach z bovínnych fetálnychobličiek, pričom sa postupovalo rovnakým sposobom. Virus z 5. priamej pasáže sa opaf podnožilna kultúrach z kuřácích zárodkov, a dalej pasážoval výhradně na fetálnych bovínnych oblickovýchkultúrach. Podraienkou rastu virusu na uvedenom druhu tkaniva s vývojom výrazných cytopatickýchzmien bolo infikovanie kultúr v subpasáži po 24 hod. rastu před vytvořením súvislého monolaye-ra. Takýmto postupom překonal šlachtený kmen 10 priamych pasáží na fetálnych bovínnych obličko-vých kultúrach. Z tohoto virusu bol na kuřácích erabrionálnych buňkách selektovaný plakovoutechnikou so šestnásobným opakováním klon predstavujúci homolognu virusové populáciu. Homoge-nita vírusovej populácie sa potvrdila zachováním nezmenenej virulencie pre vnímavé cicajúceprasata po desačnásobnom prepasážovaní na králíkoch. Takto získaný virusový klon vykazujedobré rastové vlastnosti na kultúrach připravených z kuřácích a kačacích zárodkov.

Uvedeným postupom sa získal kmen, s označením CAMP V-265 Buk-TK/650 ktorý má vlastnostivirusu vhodného pre přípravu žívej vakcíny proti Au. ch., nakolko sa vyznačuje stratou víru-lencie pre ošípané každého veku pri parenterálnej, i. nas. a iňhalačnej aplikácii, po parente-rálnom podaní sa nedokazuje v krvi, tkanivech ústredného nervového systému, mandliach anislizniciach horných dýchacích ciest, nevylučuje sa sekrétami ani exkrétami do vonkajŠiehoprostredia a neprenáša kontaktom na spoluustágnené vnímavé ošípané. Pri splnění vsetkých po-žiadaviek na neškodnost je vyšlachtený kmenň vhodný pre výrobu žívej vakcíny proti Au. ch.pre ošípané najmá v tom, že vyvolá iraunitnú odpoved aj pri aplikácii malej dávky virusu/10 ΤΚΙϋ^θ a viac/, vyvolá ochranu proti klinickému ochoreniu pri prirodzenej aj experimentál-nej infekcíí aj po jednorázovom podaní, ochrana navodená jednorázovým očkováním trvá najmenejjeden rok, dvojřázové ockovanie Vírusom v dávke 10^ ΤΚΙβ^θ a viac vyvolá tvorbu protilátekv středných az vysokých titroch s vývojora klinickej aj parciálnej bíologickej imunity, očko-vanie prasnic jedenkrát ročně poskytuje cicajúcim prasatám cestou kolostra taký stupeň pasívnejimunity, ktorá ich chrání proti ochoreniu až do 10. týzdňa veku, vyvolá pozitivnú imunitnúreakciu aj u prasiat s nízkými až střednými titrami materinských protilátok.

Používáním žívej vakcíny pripravenej z vyšlachteného kmeňa uvedených imúnobiologickýchvlastností sa dosiahne ochrana celej populácie ošípaných proti Au. ch. pri aplikovaní najjedno-duchšej imunizačnej schémy aká sa pri imunoprofylaxii tejto nákazy doposial použila; imuni-začný postup spočívá pri výkrmových ošípaných v jednorázovom očkovaní odstavciat pri ich na-skladňovaní do výkrmní, pri chovných ošípaných v jednorázovom očkovaní prasničíek a kancov voveku 10 až 12 týždňov a preočkovaní před připuštěním a jednorázovom očkovaní ročně produkČnýchkancov a prasnic bez ohladu na štádium gravidity. Pri porovnaní žívej vakcíny z vyšlachtenéhokmeňa Buk-TK/650 s ostatnými živými vakcínami domácej aj zahraničnej proveniencíe sa tátoukázala ako najlepšia čo do neškodnosti, imunogenity, chránenosti očkovaných ošípaných a jed-noduchosti imunizačnej schémy. 5 211190

Novovyšlachtený kmen podlá vynálezu Buk^TK/650 je rozlišitelný od východiskového viru-lentného kmeňa Rucarest podlá rastových vlastností a charakteru cytopatických zmien zisto’·váných na bukových kulturách, žvieratách a irounobiologických vlastností zisřovaných na zvie-ratách.

Podlá rastových vlastností na bukových kulturách sa novovyselektovaný kmeň odlisujeod východiskového virulentného kmeňa rýchlejším množením a vyšším výčažkom virusu pri pěsto-vaní na kulturách z kuřácích zárodkov, okrúhlobunečnou degeneráciou ako aj nižšími infekčný-mi titrami a nižšou akurauláciou fluoreskujúcich antigénov na kultúrach z prasačích obličiekalebo bunkovej linii PK, lokalizáciou fluoreskujúcich antigénov takmer výlučné v cytoplazmebuniek stabilnej linie TL-72. Xntranazálna aplikácia východiskového virulentného kmeňavnímavým odstavčatám vyvolá intenzívně množenie virusu na slizniciach horných dýchadiels obsahom až 10^ TKID /ml, virus přetrvává na slizniciach orofaryngu do 14. až 21. dna,pravidelné preniká do ústredného nervstva a vyvolá klinické ochorenie charakterizované ho-rúčnatým stavom, zápalom dýchacích orgánov a porúch CNS, s uhynutím okolo 50 7 infikovanýchpr asia t.

Vyselektovaný vyšlachtený kmeň sa na slizniciach horných dýchacích ciest po i. nas. apli-kácii nemnozí a dokazuje len do 24. hod. a zdravotný stav zvierat ostane celkom neporušený.Zvíeratá infikované virulentným východiskovým kmeňom vytvoria v krvnom sere neutralizačněprotilátky v titroch 1:64 až 1:1024, kým zvíeratá ošetřené vyšlachteným kmeňom len v titroch1:1 až 1:16. Aplikácia východiskového aj vyš Jachtěného kmeňa králikom vyvolá ich uhynutie, pričom však v prvom případe je domínujúcím príznakom ochorenia intenzívny pruritus, kým hynutiekrálikov ošetřených vyšlachteným kmeňom je bez príznakov svrbenia. Příklad prevedenia

Virulentný kmeň virusu Au. ch. Bukurešř sa séríovo pasážuje na primárných kultúrach zkuřácích zárodkov s použitím bežne zaužívaných laboratórnych metod. Přítomnost virusu v tka-ninových tekutinách sa na rozličnej úrovni pasážovania kontroluje vývojom vírusšpecifickýchcytopatických zmien. Postup atenuovania virulencie kmeňa sa kontroluje aplikáciou 0,5 mllog.jQ riedení virusu i. cer, a 2 až 4 ml neriedeného virusu i. nas. š tvor týždňovým prasatám,zistovaním obsahu virusu v nosných sekrétoch, vývoja lokálnych zmien, termických a celkových klinických reakcií. Po dosiahnutí takého stupňa oslabenia virulencie pasážovaného kmeňa, pri4 6 ktorom nevyvolá i. cer. aplikácia 10 TKID-^θ virusu a in. nas. aplikácia 10 ΤΚΙϋ^θ virusuklinicky pozorovatelné narušenie zdravotného stavu ošetřených prasiat, s raaxiraálnym zvýšenímtelesnej teploty o 1 °C v období do 14 dní od podania, sa virus purifikuje metodou hraničnýchriedení alebo plakovou technikou a adaptuje sa rast pri subnormálnych teplotách.

Postupuje se přitom tak, že infikované kultúry sa inkubujú najskor pri 35 °C a v pasážo-vaní virusu na skúmavkových kultúrach sa pokračuje dotial, kým nástup a vývoj cytopatickýchzmien až do úplného rozpadu tkaniva neprebehne najneskor do 72. až 96. hod. inkubácie. Potom * sa znižuje teplota, pri ktorej sa infikované skúmavkové kultúry inkubujú vždy o 1 °C podlárovnakých kritérií ako bolo uvedené vyššie. Následné sa robia priame pasáže pri 32 °C a rezi-duálna virulencia virusu testuje na 2 až 4 týždňových prasatách. Aplikuje sa im 1 ml neriede-nej infekčnej tkanivovej tekutiny do predkolennej ríasy a kontroluje přítomnost virusu na sli-zriiciach nosa a trachy, mandliach a CNS vyšetřováním vždy aspoň dvoch prasiat na 3., 5. a 7.deň od očkovania. Pasážovanie virusu pri 32 °C sa ukončí, keď sa izolačnými pokusami na buňko- vých kulturách alebo na králikoch dokáže že uvedené tkaniva sú· prosté infekcného virusu.

Tento virus sa séríovo pasážuje na skúmavkových kultúrach fetálnych bovínnych obličiek,pričom sa v období v ktorom sa na kultúrach manifestuje prítomnosč infekcie len morfologic-kýrai změnami .ojedinělých buniek, pomnoží virus na kuřácích embrycionálnych kultúrach, a v pa-sažování virusu na bovínnych obličkových buňkách sa rovnakým sposobom pokračuje. Po adaptovanívirusu natento druh tkaniva sa urobí 10 až 20 priamych sériových pasáží. Podmienkou úspěchuje, aby sa k pasážovaniu virusu použili fetálne bovínne obličkové kultúry v subpasáži po

Claims (2)

1. 211190 6 24 hod. rastu před vytvořením súvislého monolayera. Z virusu z 20. pasáže na bovínnych oblič-kových buňkách sa pomocou plakovej techniky so šesčnásobným opakováním izoluje na kuřácíchembryonálnych buňkách línia, ktorá sa podrobí kontrolnym skúškam na identitu, stupeň atenuo-vania a imunogenity. Identita virusu sa potvrdí: a. neutralizáciou infekčnosti Specifickým antisérora připra-veným na králikoch imunizovaných niektorým zo zbierkových kmeňov Aujeszkyho virusu v inakti-vovanom stave s obsahom oblejových adjuvans, b. pomocou iraunofluorescencie ofarbením kulturinfikovaných vyšlachteným kmenom Specifickým konjugovaným AV-imunoglobulínem, c. dokazomrezistencie očkovaných prasiat proti i. nas. infekcii známým virulentným kmenom. Stupeň atenuovania virulencie sa kontroluje na 2 až 4 týždňových vnímavých prasatách.Kontroluje sa přítomnost virusu u prasiat očkovaných dávkou okolo 10 ΤΚΙϋ^θ virusu naslizniciach nosa, mandliach, sliznici trachey a v CNS očkováním orgánových suspenzi! na buň-kové kultury a králíky. Iraunogenita virusu sa kontroluje očkováním vnímavých odstavčiat log.n riedeniami v dávke2 6 po 2 ml s obsahom 10 až 10 TKID virusu v inokuluj zvieratá sa vyšetrujú na obsah protilátoka infikujú i. nas. virulentným vírusom. Infekciu musia přežit prasatá, pri ktorých obsahovalo 3 inokulum 10 ΤΚΙΏ^θ virusu a viac, kým aspoň 75 % neočkovaných rovnakým spósobom infikovanýchkontrolnych ošípaných musí uhynut. Dvojrázové ínjekČné podanie virusu v dávke 105 ΤΚΙϋ^θ aviac musí vyvolat tvorbu protilátok v titroch 1:16až 1:128, s priemerným títrom najmenej1:40. Novovyšlachtený kmen podlá vynálezu Buk-TK/650 s dobrými rastovýrai vlastnostami nakulturách z kuřácích s kačacích embryí je neškodný pre ošípané každého veku pri lubovolnejaplikácii, vyvolá ochranu proti ochoreniu po jednorázovej aplikácii v malej dávke trvajúcuaspoň jeden rok a tvorbu neutralizaČných protilátok v středných až vysokých titroch po dvoj-rázovom podaní v dávke 10 ΤΚΙϋ^θ a viac. Uvedené vlastnosti kmeňa podlá vynálezu dovolujúvýrobu bezpečnej a účinnej žívej vakcíny proti Au. ch. použitím ktorej sa dosíahne spolahli-vá klinická ochrana celej populácie ošípaných proti ochoreniu pri uplatněni najjednoduchšejimunízaČnej schémy, aká sa pri imunoprofylaxii Au. ch. u ošípaných doposial použila. PREDMET VYNÁLEZU

   1. Sposob šlachtenia kmeňa virusu Aujeszkyho choroby vyznačujúci sa tým, že kmen virusu Aujeszkyho choroby Bukurešt sa najprv 150 až 250 krát pasážuje na primárných kulturách kuřácích zárodkov pri teplote 36 °'C až 38 °C, z virusu sa selektuje metodou hraničných riede- ní alebo plakovou technikou so šestnásobným opakováním línia, ktorá sa ďalej pasážuje na0 0 rovnakom druhu tkaniva pri postupnom znižovaní kultivačnej teploty o 1 C na hodnotu 30 Caž 33 °C a pri tejto teplote prepasážuje 20 až 40 krát, tento virus sa adaptuje narast na fetálne bovínne obličkové kultury a z něho selektuje na kuřácích embryonálnychbuňkách plakovou technikou so šesfnásobným opakováním hoihológna geneticky stabilná línia.
2. 2. Kmen virusu Aujeszkyho choroby avirulentný pre ošípané Buk-TK/650 CAMP V-265 sozvýšenou schopnosfou reprodukcie vlastnej vírusovej substancie na buňkových kulturách,získaný spósobom podlá bodu 1. Severografia, n. p„ závod 7, Most