CS211176B1

CS211176B1 - Sposob přípravy nosičov biologicky aktívnych látok o vysokej vázobnej kapacitě

Info

Publication number: CS211176B1
Application number: CS377080A
Authority: CS
Inventors: Juraj Zemek; Ivan Novak; Dusan Berek; Ludovit Kuniak
Original assignee: Juraj Zemek; Ivan Novak; Dusan Berek; Ludovit Kuniak
Priority date: 1980-05-29
Filing date: 1980-05-29
Publication date: 1982-01-29

Abstract

Vynález sa týká sposobu přípravy nosičov biologicky aktívnych látok o vysokej vázbovej kapacitě. Podstata vynálezu spočívá v tom, že sa xerogél. kyseliny kremíčitej, vzniknutý polymerizáciou okyslených vodných roztokov kremičítanov alkalických kovov upraví v prvom stupni anorganickými kyselinami, v druhom stupni sa získaný xerogél premyje vodou a postupné rozpúšťadlami s klesajúcou polaritou, v trečora stupni sa zbaví organických rozpúšťadiel, vysuší a vyžíha načo sa v Štvrtom stupni nechá vysušený xerogél reagovat s aminoalkylsilánom a získaný aminoalkylsílán sa aktivuje pre reakciu s biologicky aktívnymi látkami. Biologicky aktivně látky íraobilizované na nosičoch o vysokej vázbovej aktivitě majú použitie na přípravu imobilízovaných enzýmov, na imobilizáciu afínitných sorbentov, buniek, lektínov a imunochemicky aktívnych látok, vhodných pre použitie v analytike, medicíně a katalýze enzýmových procesov.

Description

Vynález sa týká epdsobu- přípravy enzýmových nosičov, nosičov afinantov a ďalších biolo” gicky aktívnych látok s vysokou vázobnou aktivitou·

Příprava nosičov biologicky aktívnych látok za účelom imobilizácie enzýmov a kovalentného viazania afinantov je ddkladne opísaná napr. v Methods in Enzymology Vol. XLIV, Immobilized Enzymes, Ed. Klaus Morbach, Academie Press, New York, San Francisco, London, 1976 alebo Jaroslava Turková: Affinity Chromatography, Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, Oxford, New York, 1978. Organické látky, napr. celulóza, polyamidy, polyakrylamíd a pod. majú ako nosiče isté nevýhody, nakolko nemajú dostatočnú mechanickú stabilitu, sú stlačitelné a nemožu sa použiť za vyšších tlakov a sú citlivé na změny rozpúšťadiel, voči změnám pH a ionovej sily a sú biodegradabilné. Z toho ddvodu sa Častokrát uprednostňujú látky anorganického povodu s biologicky aktívnymi látkami viazanými kovalentnou vázbou pomocou špecifických funkčných skupin.

Z anorganických materíálov ako nosiče sú popisované kysličníky hliníka, niklu, titánu, železa, zirkonu, ďalej hydroxyapatit, kremičitany a porézně sklo /Methods in Enzymology, Vol. XLIV, uvedené z hora/. Nevýhodou uvedených materíálov je ich poměrně nízký měrný povrch /do 100 m²/g/, v případe kysličníkov kovov neinertnosť povrchu a konečne poměrně vysoké výrobně náklady, ktoré nosiče na báze skla o kontrolovanej velkosti porov robia ťažko přístupnými pre širšie technologické využitie. Nakolko nosiče anorganického pdvodu nemajú funkcné skupiny schopné bezprostrednej chemickej reakcie s enzýmom, afinantom a ďalšími biologicky aktívnymi látkami, je nutná ich úprava, napr. pomocou aminoalkylsilánov, čím sa na povrch generujú organické funkčné skupiny /napr. alkylamín/. Stupeň substitúcie nosičov anorganického povodu organickými funkčnými skupinami je závislý od počtu reakcieschopných anorganických funkčných skupin. Počet reakcieschopných anorganických funkčných skupin je úměrný měrnému povrchu enzýmového nosiča. Tak napr. stupeň alkylaminosilánu u /CPG 10-2 000/, skla s kontrolovanou velkosťou porov o mernom povrchu 12,5 m² a strednej velkosti porov 120 nm je 80 mol/kg. Je však doležité, aby nedošlo u nosičov s vysokým specifickým povrchom ďalšou úpravou k zhoršeniu mechanických vlastností natolko, aby sa nedali uplatniť v rámci technologického procesu.

Značná časť - SiOH skupin je pre viazanie enzýmov nevyužitelná z priestorových ddvodov lebo sa nachádza v mikroporoch. Objem porov nosičov na báze silikagelu alebo pórovitého skla málokedy přesahuje 1 cm^/g. Z uvedených dovodov je vazbová kapacita anorganických nosičov pre enzýmy obvykle poměrně nízká. Příprava anorganických nosičov biologicky aktívnych látok o vysokej vázbovej kapacitě, ktorá odstraňuje zhora uvedené nedostatky nosičov anorganického povodu je zahrnutá v predkladanom vynáleze.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že sa vlhký xerogél kyseliny kremičitej, vzniknutý polymerizáciou okyslených vodných roztokov kremičitanov alkalických kovov upravuje v prvom stupni anorganickými kyselinami, s výhodou kyselinou sírovou, alebo kyselinou chlorovodíkovou alebo kyselinou dusičnou alebo kyselinou fosforečnou alebo organickými kyselinami, ako napr. kyselinou trichloroctovou a v druhom stupni sa získaný xerogél premýva najprv vodou a postupné rozpúšťadlami s klesajúcou polaritou s výhodou etanolu a acetonu, načo sa produkt v treťom stupni zbaví organických rozpúšťadiel, vysuší a vyžíha pri teplotách 200 až 900 °C, s výhodou pri teplote 700 až 750 °C, načo sa v štvrtom stupni vysušený xerogél nechá reagovať s aminoalkylsilánom /s výhodou gama-aminopropyltrietoxysilánom/ pri teplote 100 až 110 °C, po dobu 2 až 10 hodin a získaný aminoalkylsílán sa aktivuje známými postupmi pre reakciu s biologicky aktívnymi látkami.

Výhodou postupu přípravy nosičov biologicky aktívnych látok podlá uvedeného vynálezu je:

- vysoký objem porov a koncentrácia - SiOH skupin, ktoré rezultujú vo

- vysoký stupeň substitúcie silikagelu organickými funkčnými skupinami /až 1,76 mol/kg/

- vyhovujúce mechanické vlastnosti pre násadové aj kolonové použitie, včítane vysokotlakových kolon

- nízké výrobně náklady a tomu zodpovedájúca nízká cena připraveného nosiča.

Příklady prevedenia

Přiklad 1

200 ml vodného roztoku křemičitanů sodného /vodného skla/ o obsahu 9,20 JS hmot. S1O2 sa zmieša so 130 ml 3 % hmot. kyseliny dusičnej a zhomogenizuje sa. Vzniknutá zatuhnutá masa hyd” rogélu kyseliny kremičitej sa mechanicky rozruší a rozmieŠa s 250 ml 65/S-nej kyseliny dusičnej alebo 160 ml konc. kyseliny sírovej alebo 300 ml 55 % hmot, kyseliny fosforečnej alebo 200 g kyseliny trichloroctovej a ponechá sa za občasného zamiešania do druhého dfta, ked sa zmes zriedi destilovanou vodou, sfiltruje a dokonale premyje destilovanou vodou do neutrálnej reakcie, naČo sa dalej premýva postupné etylakoholom a nakoniec acetonom. Materiál sa zbaví zvyáku organických rozpúštadiel vysušením a stabilizuje sa pri teplotách 200 až 900 °C, s výhodou pri 700 až 750 °C.

Získaný silikagel /10 g/ s vysokým měrným povrchom /500 m^ g-1 as objemom porov 2 až ml g“1/ a s priemernými rozmermi pórov 20 nm, sa temperoval po dobu 10 hodin pri teplote 550 °C, Aktivovaný silikagel /10 g/ sa použil na silanizáciu, ktorá sa vykonala v 10%-nom roztoku gama-aminopropyltrietoxysílánu v toluéne /100 ml/, pri teplote 110 °G, po dobu 10 hodin. Produkt sa po silanizácii premýval nadbytkom teluénu /600 ml/ a v dalšom nadbytku toluénu /400 ml/ sa získaný produkt zohrieval po dobu 4 hodin pro 110 °C za účelom dokonalej extrakcie nezreagovaného gama-aminopropyltrietoxysilánu. Premytý derivát silikagélu sa sušil cez noc pri teplote 100 °C a charakterizoval na obsah primárných aminoskupín pomocou metody využívajúcej 2,4,6-trinitrobenzénsulfonovú kyselinu /H. Wand, M. Rudel, H. Dantzemberg, Z. Chemie, 18, 224, 1978/, Obsah primárných aminoskupín bol 1,42 mol/kg, Silikagel s primárnými aminoskupinami /10 g/ sa nechal dalej reagovat s tiofosgénom. /Použil sa 10%-ný roztok tiofosgénu v 200 ml chloroformu/ pri teplote 100 °C cez noc. Derivatizovaný silikagel sa premyl nadbytkom 800 ml chloroformu a vysušil. Primárné aminoskupiny ea previedli kvantitativné na izotiokyanátové funkčné skupiny, čomu zodpovedá vázbová kapacita modifikovaného silikagelu voči /U-14_c/ L-cysteínu /1,41 mol/kg/ a /U-^C/ L-valínu /1,36 mol/kg/.

Takto připravený nosič možno použit na imobilizáciu biologicky aktívnych látok, napr. enzýmov. Tak peeudocholínesteráza /acetylcholín acyl hydroPSea, EC 3.1.1.8/ z konskej plazmy /0,5 g; 2 (ukat . mg”V sa rozpustila v 200 ml 0,02 M borátového pufru /pH 8,5/ a přidalo sa 10 g polyizotiokyanátového derivátu silikagelu. Xmobilizácia sa vykonala za miešania po dobu hodin pri teplote miestnosti. Nezreagovaný rozpustný enzým sa vymyl 2 M NaCl /500 ml/. Imobilizovaný enzým si podržel aktivitu 71 Qikat . g^-^ vo zvlhčenom stave pri teplote 4 °C po dobu 60 dní.

Príklad2

Silikagél /10 g/obsahujúci primárné aminoskupiny, připravený tak, ako je uvedené v příklade 1 sa homogénne zalial 2 ml vody a přidalo sa 10 ml 2-chlórmetylaxiránu. Reakcia prebiehala 3 hodiny pri izbovej teplote a potom 30 minút pri 40 °C, Reakčný produkt sa premyl etanolem, vysušil a charakterizoval sa obsah oxiranových funkčných skupin 1,2 mol/kg. Takto připravený nosič /10 g/ sa použil k ímobílizácíí pseudocholinesterázy z konskej plazmy /0,5 g;

(ukat . mg”1/ rozpuštěný v 200 ml 0,02 M borátového pufru /pH 8,5/, Imobilizácia sa vykonala za pretrepávania na meehanickej trepačke 4 hodiny pri teplote miestnosti. Nezreagovaný rozpustný enzým sa vymyl 2 M NaCl /500 ml/,

Imobilizovaný enzým si podržal aktivitu 67,5 ukat . g“\ vo zvlhčenom stave pri 4 °C po dobu 90 dní.

Příklad 3

Tak. ako je uvedené v příklade 1 s tým rozdielom, že reakcia silanizacio silikagelu pornocou gama-aminopropyltrietoxysilánu sa vykonala pri teplote 100 °C po dobu 2 hodin a získaný aminopropylderivát silikagelu s obsahom primárných aminoskupín 1,76 mol/kg sa previedol v reakcii s tiofosgénom na polyizotiokyanát s obsahom isotiokyanátových skupin 1,66 mol/kg. Uvedený polyizotiokyanát silikagelu /1 g/ sa použil na reakciu s p~/omega-amínomety1/ fenylboronovou kyselinou /0,3 g/ a získaný boronový derivát silikagélu sa použil na afinitnú sorbciu enzýmov so serínom v aktívnom centre.

Příklad 4

Tak ako je uvedené v příklade 1 s týni rozdielom, že na reakciu siianizácie sa použil silikagel s měrným povrchom 30 m^/g. Obsah primárných aminoskupín v získanom alkylamínosíláne bol 0,22 mol/kg. Získaný amínoalky1si1ikagé1 /10 g/ sa nechal reagovat s anhyuridom kyseliny jantárovej /3 g/ v chloroforme /200 ml/ pri teplote 80 °C po dobu 2 hodin, Reakčný produkt sa premyl vo vodě /500 ml/ a v acetone /300 ml/ a vysušil. SalŠia modifikácia silikagélu, obsahujúceho volné karboxylové skupiny /0,19 mol/kg/ sa vykonala v 2%~nom vodnom roztoku 1-cyklohexy1-3-/2-morfolinoetyl/karbodíimidu o pH 4,8 za miešania pri izbovej teplote po dobu 1 hodiny. Získaný derivatizovaný silikagél sa premyl 4 rázy vodou /500 ml/ a íraobilizácía pseudochlínesterázy sa vykonala rovnako, ako je uvedené v příklade 1, s tým rozdielom, že teplota pri reakcii sa udržiavala v rozmedzí 0 až 2 °C,

Aktivita imob i 1 i zovane j pseudocholínesterázy bola 52 pikat . g*^.

Příklad. 5

Tak ako uvedené v příklade 1, s tým rozdielom, že namiesto pseudocholínesterázy sa použila glukoamyláza /alfa-1,4-glukan glukohydro1áza, EC, 3.2.1.3/ z Endomycopsis bispora.

Aktivita imobi1 izovaného enzýmu bola 60,-2 ^ukat g~\

Biologicky aktivně látky imobilizované na uvedených nosičoch o vysokej vSzobnej aktivitě možno použit na pripravu zmobilizovaných enzýmov, na ímobilizáciu afinitných sorbentov, buniek, lektínov a imunochemicky aktívnych látok, vhodných pre použitie v analytike, medicíně a katalýze enzýmových procesov.

Claims

Sposob pripravy nosičov biologicky aktívnych látok o vysokej vázbovej kapacitě vyznačený tým, že vlhký xerogél kyseliny kremičitej, vzniknutý polymerizáciou okyslených vodných roztokov kremičitanov alkalických kovov sa upravuje v prvom stupni anorganickými kyselinami, s výhodou kyselinou sírovou, alebo kyselinou chlorovodíkovou alebo kyselinou dusičnou alebo kyselinou fosforečnou alebo organickými kyselinami, s výhodou s kyselinou trichloroctovou a v druhom stupni sa získaný xerogél premýva najprv vodou a postupné rozpúštadlami s klesajúcou polaritou s výhodou etylalkoholu a acetonu, naco sa produkt v tretom stupni zbaví organických rozpúštadiel, vysuší a vyžíha pri teplotách 200 až 900 °C, s výhodou pri teplote 700 až 750 °C, naco sa v štvrtom stupni vysušený xerogél nechá reagovat s amínoalkyIsilánom s výhodou s gama-amínopropyltrietoxysilánom pri teplote 100 až 110 °C, po dobu 2 až 10 hodin a získaný aminoalkylsilán sa aktivuje známými postupmi pre reakciu s biologicky aktívnymi látkami.