CS211176B1 - Sposob přípravy nosičov biologicky aktívnych látok o vysokej vázobnej kapacitě - Google Patents

Description

1 211176

Vynález sa týká epdsobu- přípravy enzýmových nosičov, nosičov afinantov a dalších biolo-gicky aktívnych látok s vysokou vázobnou aktivitou· Příprava nosičov biologicky aktívnych látok za účelom imobilizácie enzýmov a kovalentné-ho viazania afinantov je ddkladne opísaná napr. v Methods in Enzymology Vol. XLIV, Immobili-zed Enzymes, Ed. Klaus Morbach, Academie Press, New York, San Francisco, London, 1976 aleboJaroslava Turková: Affinity Chromatography, Elsevi-er Scientific Publishing Company, Amster-dam, Oxford, New York, 1978. Organické látky, napr. celulóza, polyamidy, polyakrylamíd a pod.majú ako nosiče isté nevýhody, nakolko nemajú dostatočnú mechanická stabilitu, sú stlačitelnéa nemožu sa použit za vyšších tlakov a sú citlivé na změny rozpúštadiel, voči změnám pH aionovej sily a sú biodegradabilné. Z toho důvodu sa Častokrát uprednostňujú látky anorganic-kého povodu s biologicky aktívnymi látkami viazanými kovalentnou vázbou pomocou Specifickýchfunkčných skupin. Z anorganických materiálov ako nosiče sú popisované kysličníky hliníka, niklu, titánu,železa, zirkonu, ďalej hydroxyapatit, kremičitany a porézně sklo /Methods in Enzymology, Vol.XLIV, uvedené z hora/. Nevýhodou uvedených materiálov je ich poměrně nízký měrný povrch /do100 m2/g/, v případe kysličníkov kovov neinertnost povrchu a konečne poměrně vysoké výrobněnáklady, ktoré nosiče na báze skla o kontrolovanej velkosti porov robia tažko přístupnýmipre širšie technologické využitie. Nakolko nosiče anorganického pdvodu nemajú funkčně skupinyschopné bezprostrednej chemickej reakcie s enzýmom, afinantom a dalšími biologicky aktívnymilátkami, je nutná ich úprava, napr. pomocou aminoalkylsilánov, čím sa na povrch generujú or-ganické funkčně skupiny /napr. alkylamín/. Stupeň substitúcie nosičov anorganického povoduorganickými funkčnými skupinami je závislý od počtu reakcieschopných anorganických funkčnýchskupin. Počet reakcieschopných anorganických funkčných skupin je úměrný měrnému povrchu enzý-mového nosiča. Tak napr. stupeň alkylaminosilánu u /CPG 10-2 000/, skla s kontrolovanou vel-kostou porov o mernom povrchu 12,5 m2 a strednej velkosti porov 120 nm je 80 mol/kg. Je všakdoležité, aby nedošlo u nosičov s vysokým specifickým povrchom dalšou úpravou k zhoršeniu me-chanických vlastností natolko, aby sa nedali uplatnit v rámci technologického procesu.

Značná část - SiOH skupin je pre viazanie enzýmov nevyužitelná z priestorových dSvodovlebo sa nachádza v mikroporoch. Objem porov nosičov na báze silikagelu alebo pórovitého sklamálokedy přesahuje 1 cm^/g. Z uvedených dovodov je vázbová kapacita anorganických nosičov preenzýmy obvykle poměrně nízká. Příprava anorganických nosičov biologicky aktívnych látok o vy-sokej vázbovej kapacitě, ktorá odstraňuje zhora uvedené nedostatky nosičov anorganického povo-du je zahrnutá v predkladanom vynáleze.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že sa vlhký xerogél kyseliny kremičitej, vzniknutý po-lymerizáciou okyslených vodných rožtokov kremičitanov alkalických kovov upravuje v prvom stup-ni anorganickými kyselinami, s výhodou kyselinou sírovou, alebo kyselinou chlorovodíkovoualebo kyselinou dusičnou alebo kyselinou fosforečnou alebo organickými kyselinami, ako napr.kyselinou trichloroctovou a v druhom stupni sa získaný xerogél premýva najprv vodou a postupnérozpúštadlami s klesajúcou polaritou s výhodou etanolu a acetonu, načo sa produkt v tretomstupni zbaví organických rozpúštadiel, vysuší a vyžíha pri teplotách 200 až 900 °C, s výhodoupri teplote 700 až 750 °C, načo sa v štvrtom stupni vysušený xerogél nechá reagovat s amino-alkylsilánom /s výhodou gama-aminopropyltrietoxysilánom/ pri teplote 100 až 110 °C, po dobu2 až 10 hodin a získaný aminoalkylsilán sa aktivuje známými postupmi pre reakciu s biologickyaktívnymi látkami. Výhodou postupu přípravy nosičov biologicky aktívnych látok podlá uvedeného vynálezu je: - vysoký objem porov a koncentrácia - SiOH skupin, ktoré rezultujú vo - vysoký stupeň substitúcie silikagelu organickými funkčnými skupinami /až 1,76 mol/kg/ - vyhovujúce mechanické vlastnosti pre násadové aj kolonové použitie, včítane vysokotla-kových kolon - nízké výrobně náklady a tomu zodpovedajúca nízká cena připraveného nosiča. 211176 2 Příklady prevedenia Příklad 1 200 ml vodného roztoku kremicitanu sodného /vodného skla/ o obsahu 9,20 7„ hmot. S1O2 sazmieša so 130 ml 3 % hmot. kyseliny dusičnej a zhomogenizuje sa. Vzniknutá zatuhnutá masa hyd”rogélu kyseliny kremičitej sa mechanicky rozruší a rozmieŠa s 250 ml 65/S-nej kyseliny dusičnejalebo 160 ml konc. kyseliny sírovej alebo 300 ml 55 % hmot. kyseliny fosforečnej alebo 200 gkyseliny trichloroctovej a ponechá sa za občasného zamiešania do druhého dfta, ked sa zmeszriedi destilovanou vodou, sfiltruje a dokonale premyje destilovanou vodou do neutrálnej re-akcie, naČo sa dalej premýva postupné etylakoholom a nakoniec acetonom. Materiál sa zbavízvyáku organických rozpúšČad iel vysušením a stabilizuje sa pri teplotách 200 až 900 °C, s vý-hodou pri 700 až 750 °C. Získaný silikagel /10 g/ s vysokým měrným povrchom /500 m^ g”1 as objemom porov 2 až 3 ml g“1/ a s priemernými rozmermi pórov 20 nm, sa temperoval po dobu 10 hodin pri teplote550 °C, Aktivovaný silikagel /10 g/ sa použil na silanizáciu, ktorá sa vykonala v 10%-nomroztoku gama-aminopropyltrietoxysílánu v toluéne /100 ml/, pri teplote 110 °G, po dobu 10 ho-din. Produkt sa po silanizácii premýval nadbytkom teluénu /600 ml/ a v dalšom nadbytku toluénu/400 ml/ sa získaný produkt zohrieval po dobu 4 hodin pro 110 °C za účelom dokonalej extrakcienezreagovaného gama-aminopropyltrietoxysilánu. Premytý derivát silikagélu sa sušil cez noc pri teplote 100 °C a charakterizoval na obsah primárných aminoskupín pomocou metody využívajú-cej 2,4,6-trinitrobenzénsulfonovú kyselinu /H. Wand, M. Rudel, H. Dantzemberg, Z. Chemie, 18,224, 1978/, Obsah primárných aminoskupín bol 1,42 mol/kg, Silikagel s primárnými aminoskupi-nami /10 g/ sa nechal dalej reagovat s tiofosgénom. /Použil sa 10%-ný roztok tiofosgénuv 200 ml chloroformu/ pri teplote 100 °C cez noc. Derivatizovaný silikagel sa premyl nadbyt-kom 800 ml chloroformu a vysušil. Primárné aminoskupiny sa previedli kvantitativné na izotio-kyanátové funkčně skupiny, čomu zodpovedá vázbová kapacita modifikovaného silikagélu voči/U-14c/ L-cysteínu /1,41 mol/kg/ a /U-^C/ L-valínu /1,36 mol/kg/.

Takto připravený nosič možno použit na imobilizáciu biologicky aktívnych látok, napr.enzýmov. Tak peeudocholínesteráza /acetylcholín acyl hydroPSea, EC 3.1.1.8/ z konskej plazmy/0,5 g; 2 (ukat . mg”V sa rozpustila v 200 ml 0,02 M borátového pufru /pH 8,5/ a přidalo sa10 g polyizotiokyanátového derivátu silikagélu. Xmobilizácia sa vykonala za miešania po dobu 4 hodin pri teplote miestnosti. Nezreagovaný rozpustný enzým sa vymyl 2 M NaCl /500 ml/. Imo-bilizovaný enzým si podržel aktivitu 71 Qikat . g”^ vo zvlhčenom stave pri teplote 4 °C po do-bu 60 dní.

Príklad2

Silikagél /10 g/obsahujúci primárné aminoskupiny, připravený tak, ako je uvedené v pří-klade 1 sa homogénne zalial 2 ml vody a přidalo sa 10 ml 2-chlórmetylaxiránu. Reakcia prebie-hala 3 hodiny pri izbovej teplote a potom 30 minút pri 40 °C. Reakčný produkt sa premyl eta-nolem, vysušil a charakterizoval sa obsah oxiranových funkčných skupin 1,2 mol/kg. Takto při-pravený nosič /10 g/ sa použil k ímobílizácíí pseudocholinesterázy z konskej plazmy /0,5 g; 2 (ukat . mg”V rozpuštěný v 200 ml 0,02 M borátového pufru /pH 8,5/, Imobilizácia sa vykonalaza pretrepávania na mechanickej trepačke 4 hodiny pri teplote miestnosti. Nezreagovaný roz-pustný enzým sa vymyl 2 M NaCl /500 ml/,

Imobilizovaný enzým si podržal aktivitu 67,5 ukat . g“\ vo zvlhčenom stave pri 4 °C podobu 90 dní.

Claims (1)

1. 3 211176 Příklad 3 Tak. ako je uvedené v příklade 1 s tým rozdielom, že reakcia si lanizaci e silikagélu porno-cou gama-aminopropyltrietoxysilánu sa vykonala pri teplete 100 °C po dobu 2 hodin a získanýaminopropylderivát silikagélu a obsahom primárných aminoskupín 1,76 mol/kg sa previedol v re-akcii s tiofosgénom na polyizotiokyanát s obsahom isotiokyanátových skupin 1,66 mol/kg. Uve-dený polyizotiokyanát silikagélu /1 g/ sa použil na reakciu s p~/oiaega-amínomety1/ fenylboro-novou kyselinou /0,3 g/ a získaný boronový derivát silikagélu sa použil na afinitnd sorbciuenzýmov so serínom v aktívnom centre. Příklad 4 Tak ako je uvedené v příklade 1 s týni rozdielom, že na reakciu siianizácie sa použilsilikagél s měrným povrchoiu 30 m^/g. Obsah primárných aminoskupín v získanom alkylamínosilánebol 0,22 mol/kg. Získaný aminoalky1si1ikagé1 /10 g/ sa nechal reagovat s anhyuridom kyselinyjantárovej /3 g/ v chloroforme /200 ml/ pri teplote 80 °C po dobu 2 hodin, Reakčný produkt sapremyl vo vodě /500 ml/ a v acetone /300 ml/ a vysušil. SalŠia modifikácia silikagélu, obsa~hujúceho volné karboxylové skupiny /0,19 mol/kg/ sa vykonala v 2%~nom vodnom roztoku 1-cyklo-hexy1-3-/2-morfolinoety1/karbodiiraidu o pH 4,8 za miešanxa pri izbovej teplote po dobu 1 ho-diny. Získaný derivatizovaný silikagél sa premyl 4 rázy vodou /500 ml/ a íraobilizácía pseudo-chlínesterázy sa vykonala rovnako, ako je uvedené v příklade 1, s tým rozdielom, že teplotapri reakcii sa udržiavala v rozmedzí 0 až 2 °C, Aktivita imob i 1 i zovane j pseudocholínesterázy bola 52 pikat . g"*^. Příklad. 5 Tak ako uvedené v příklade 1, s tým rozdielom, že namiesto pseudocholínesterázy sa po-užila glukoamyláza /a1fa-1,4-glukan glukohydro1áza, EC, 3.2.1.3/ z Endomycopsis bispora. Aktivita imobi1 izovaného etizýmu bola 60,-2 £ikat g~\ Biologicky aktivně látky imobilizované na uvedených nosičoch o vysekej vSzobnej aktivitěmožno použit na přípravu zmobilizovaných enzýmov, na imobilizáciu afínitných sorbentov, buniek,lektínov a imunochemicky aktívnych látok, vhodných pre použitie v analytike, medicíně a kata-lýze enzýmových procesov. PREDMET VYNÁLEZU Spósob přípravy nosičov biologicky aktívnych látok o vysokej vázbovej kapacitě vyznačenýtým, že vlhký xerogél kyseliny kremičitej, vzniknutý polymerizáciou okyslených vodných rozto-kov kremičitanov alkalických kovov sa upravuje v prvom stupni anorganickými kyselinami, s vý-hodou kyselinou sírovou, alebo kyselinou chlorovodíkovou alebo kyselinou dusičnou alebo kyse-linou fosforečnou alebo organickými kyselinami, s výhodou s kyselinou tríchlóroctovou a v dru-hom stupni sa získaný xerogél premýva najprv vodou a postupné rozpúštadlami s kiesajúcou pola-ritou s výhodou etylalkoholu a acetonu, naco sa produkt v tretom stupni zbaví organickýchrozpúštadiel, vysuší a vyžíha pri teplotách 200 až 900 °C, s výhodou pri teplote 700 až 750 °C,naco sa v štvrtom stupni vysušený xerogél nechá reagovat s aminoalkyIsilánom s výhodou s gama--aminopropyltrietoxysilánom pri teplote 100 až 110 °C, po dobu 2 až 10 hodin a získaný amino-alkylsilán sa aktivuje známými postupmi pre reakciu s biologicky aktívnymi látkami. Severografia, n. p.. závod 7, Most